血管生成素1腺病毒載體的構(gòu)建及其對內(nèi)毒素性肺損傷炎癥消退的影響.pdf

1、目的:克隆人血管生成素1基因（hAng1），采用AdMax包裝系統(tǒng)構(gòu)建含人血管生成素1的重組腺病毒質(zhì)粒，為研究血管生成素1對急性肺損傷中炎癥消退的作用奠定基礎(chǔ)。方法:將hAng1Cdna克隆于真核表達(dá)載體Pdc315-EGFP，得到重組質(zhì)粒Pdc315-EGFP-Ang1，采用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)（Cre/Loxp）將Pdc315-EGFP-Ang1與Pbhg lox ΔE1,3 Cre輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，生成帶有Ang

2、1基因的重組腺病毒載體Ad-EGFP-Ang1，重組腺病毒質(zhì)粒在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增，氯化銫梯度離心純化。檢測轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞中以及細(xì)胞培養(yǎng)上清中的Ang1蛋白表達(dá)。結(jié)果:經(jīng)酶切鑒定和測序證實(shí)載體構(gòu)建正確，病毒滴度為1.5×1012 PFU·Ml-1。Ad-EGFP-Ang1轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清中均檢測出Ang1蛋白。結(jié)論:帶有hAng1Cdna的重組腺病毒載體構(gòu)建成功，可用于對急性肺損傷炎癥消退的影響的研究。<

3、br>　　 第二部分 氣管內(nèi)滴入脂多糖致小鼠內(nèi)毒素性
　　 肺損傷模型的建立
　　 目的:氣管滴入脂多糖復(fù)制小鼠急性肺損傷模型，為進(jìn)一步探討炎癥反應(yīng)過程奠定基礎(chǔ)。方法:將20只SPF級雄性BALB/c小鼠（20-25g）隨機(jī)分為對照組和脂多糖組，每組10只小鼠，麻醉后分別經(jīng)氣管插管滴入生理鹽水（對照組）和脂多糖3 mg·kg-1（脂多糖組）。觀察24小時死亡率、肺組織濕干重比、病理改變，肺泡灌洗液中的白細(xì)胞計數(shù)、中性粒

4、細(xì)胞計數(shù)和總蛋白濃度。 結(jié)果:脂多糖組小鼠死亡率33.3％，對照組沒有小鼠死亡。脂多糖組肺組織病理評分、肺組織濕干重比、肺泡灌洗液中的白細(xì)胞計數(shù)、中性粒細(xì)胞計數(shù)和總蛋白濃度均高于對照組，（P=0.001）。結(jié)論:氣管滴入脂多糖3 mg·kg-1成功模擬了ALI的過程，是進(jìn)一步探討炎癥反應(yīng)過程的可靠的ALI動物模型。
　　 第三部分 血管生成素1促進(jìn)內(nèi)毒素性肺損傷炎癥消退
　　 目的:通過基因轉(zhuǎn)染增加血清中血管生成素1（A

5、ng1）的濃度，探討血管生成素1基因治療對急性肺損傷炎癥消退的影響。方法:SPF級BALB/c小鼠隨機(jī)分為三組：對照組，GFP組和Ang1組。對照組：取4只小鼠，靜脈注入空腺病毒載體，24小時后氣管滴入生理鹽水。GFP組和Ang1組氣管內(nèi)滴入脂多糖構(gòu)建急性肺損傷動物模型前，分別經(jīng)尾靜脈注入空腺病毒載體（Ad-GFP，GFP組）和攜帶血管生成素1的腺病毒載體（Ad-GFP-Ag1，Ang1組）。經(jīng)氣管滴入脂多糖后4h、12h、24h、48

6、h、72h、96h處死小鼠，取肺泡灌洗液收集細(xì)胞，行細(xì)胞計數(shù)分類，并用流式檢測中性粒細(xì)胞凋亡和被巨噬細(xì)胞吞噬情況。收集肺組織和肝臟組織以及血清，檢測血管生成素1的基因和蛋白表達(dá)。檢測肺泡灌洗液中的粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子濃度變化。結(jié)果:LPS氣管滴入后大量的白細(xì)胞浸潤到肺組織和肺泡腔，早期以中性粒細(xì)胞為主，在48h白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞達(dá)到最大值。Ang1預(yù)處理增加了ang1在肝臟的表達(dá)，分泌到血清中，減少了炎性細(xì)胞浸潤并促進(jìn)了中性粒細(xì)胞

7、的凋亡和吞噬，從而加速了中性粒細(xì)胞從組織的清除，同時，增加了肺泡灌洗液中的粒細(xì)胞單核細(xì)胞集落刺激因子濃度。結(jié)論:血管生成素1預(yù)處理促進(jìn)了急性肺損傷炎癥消退，這與其促進(jìn)中性粒細(xì)胞的凋亡和巨噬細(xì)胞吞噬有關(guān)。
　　 1經(jīng)頸透照明視下完成并證實(shí)小鼠氣管插管成功，經(jīng)氣管插管滴入3mg·kg-1脂多糖可以成功復(fù)制ALI模型。
　　 2脂多糖3mg·kg-1氣管滴入后48小時，肺組織炎癥達(dá)高峰，隨后進(jìn)入炎癥消退期。血管生成素1預(yù)處