蠟梅八氫番茄紅素脫氫酶基因CpPds的克隆與表達分析.pdf

1、類胡蘿卜素(Carotenoids)是自然界中最豐富的萜類色素物質(zhì)，廣泛存在于細菌、真菌以及植物中。迄今為止，在自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了750多種類胡蘿卜素。類胡蘿卜素主要是作為光合生物光合膜的重要組成成份來行使其功能的。它在光合作用中發(fā)揮著重要的作用。類胡蘿卜素也是很多花和果實中的主要色素。1950年，Porter和Lincoln首先提出了高等植物類胡蘿卜素生物合成途徑，目前植物類胡蘿卜素生物合成過程中幾乎所有的基因都已經(jīng)分離和鑒定出來了。

2、八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoenedehydrogenase)是催化類胡蘿卜素生物合成過程中的主要限速酶，催化無色的八氫番茄紅素(Phytoene)脫氫，生成番茄紅素(Lycopene)，進而轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩念惡}卜素。八氫番茄紅素脫氫酶位于葉綠體的類囊體膜上，對葉綠體起到一種特殊的保護作用。當(dāng)編碼該蛋白的基因被沉默，葉綠體失去了這種酶的保護作用，導(dǎo)致葉綠素降解，富含葉綠素的葉片等組織斑駁、褪色、黃化甚至變成白色，此種現(xiàn)象就稱為光漂白現(xiàn)象

3、。這種表型很容易分辨。所以八氫番茄紅素脫氫酶基因常作為近年來新興發(fā)展的病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-inducedgenesilencing，VIGS)體系的報告基因。蠟梅八氫番茄紅素脫氫酶基因的克隆，為下一步在蠟梅中建立VIGS體系打下基礎(chǔ)。
　　 本論文根據(jù)已知的八氫番茄紅素脫氫酶基因的同源序列，通過簡并PCR結(jié)合RACE技術(shù)，克隆得到蠟梅八氫番茄紅素脫氫酶基因的全長cDNA。命名為CpPds，(Genbankaccess

4、ion:KC814175)。通過對該基因和其所編碼的蛋白進行序列特征分析;熒光定量PCR檢測CpPds在蠟梅不同組織和不同時期的轉(zhuǎn)錄表達水平;構(gòu)建植物超表達載體，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株，對CpPds進行功能的初步研究。主要的研究結(jié)果如下:
　　 1.蠟梅CpPds基因的克隆和生物信息學(xué)分析
　　 根據(jù)已知的八氫番茄紅素脫氫酶基因的同源序列，設(shè)計簡并引物，通過簡并PCR方法獲得蠟梅八氫番茄紅素脫氫酶基因cDNA的核心片段。以此

5、片段為基礎(chǔ)，通過RACE方法，克隆得到該基因的兩端片段。根據(jù)拼接得到的電子全長，設(shè)計全長引物，最終克隆得到蠟梅八氫番茄紅素脫氫酶基因cDNA的物理全長。蠟梅Pds基因cDNA全長2242bp，ORF框為1716bp，編碼一個含有571個氨基酸的蛋白質(zhì)。蛋白的分子量為64.28kD，預(yù)測的理論等電點值為7.94。在NCBI上對CpPds編碼的蛋白質(zhì)進行保守結(jié)構(gòu)域同源性分析，表明CpPDS蛋白屬于NAD結(jié)合蛋白。蛋白編碼區(qū)序列在各個物種中表

6、現(xiàn)出較高的同源性，可以說明八氫番茄紅素脫氫酶基因作為功能基因在進化中比較保守。在CpPds編碼的蛋白序列與其他植物的PDS蛋白序列之間構(gòu)建NJ進化樹，結(jié)果顯示蠟梅PDS蛋白在進化上介于雙子葉和單子葉植物之間，且與兩種單子葉植物的PDS蛋白的遺傳距離較近，可能是蠟梅PDS蛋白比較保守，在進化上處于較低等的位置。信息學(xué)分析表明，該蛋白無信號肽，沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，含有38潛在的個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點，屬于比較穩(wěn)定的親水性蛋白，亞細胞定位預(yù)

7、測顯示該蛋白最可能在線粒體基質(zhì)中發(fā)揮作用。
　　 2.CpPds基因的轉(zhuǎn)錄水平分析
　　 分析CpPds在蠟梅不同組織和花發(fā)育不同時期的表達水平，結(jié)果表明CpPds基因在蠟梅各個組織和花發(fā)育不同時期均有表達，說明該基因可能是組成型表達。伴隨著花朵逐漸開放到衰老，其表達量呈現(xiàn)整體升高的趨勢，在衰敗期達到峰值。推測CpPds基因編碼的蛋白可能與蠟梅花器官的衰老有關(guān)，在蠟梅花衰老過程中調(diào)節(jié)著類胡蘿卜素的積累。相對于花和葉片的高

8、表達量，在莖中的表達量較低，且除雌蕊外，在外瓣、中瓣、內(nèi)瓣、雄蕊中的表達量都相當(dāng)且較高，說明CpPds參與蠟梅花的發(fā)育過程。推測CpPds基因在蠟梅花類胡蘿卜素積累和花的顯色中可能起著重要作用。
　　 3.CpPds在轉(zhuǎn)基因煙草中的超表達
　　 構(gòu)建植物超表達載體pCAMBIA2301g-CpPds，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將pCAMBIA2301g-CpPds轉(zhuǎn)入煙草植株中，通過抗性篩選、Gus