miR-291a-b-5p在小鼠著床前胚胎發(fā)育的表達(dá)變化及作用研究.pdf

1、目的：
　　哺乳動物著床前胚胎發(fā)育、分化及胚胎基因組激活的調(diào)控機(jī)制是生殖醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)問題之一。研究著床前胚胎基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，對于深入認(rèn)識著床前胚胎發(fā)育過程，提高人類輔助生殖助孕技術(shù)的成功率，揭示不孕與不育、出生缺陷及某些遺傳性疾病的發(fā)病機(jī)理有重要意義。由于小鼠基因組和人類基因組具有廣泛的同源性；同時，小鼠胚胎和人類胚胎具有許多共同的特征。因此，對于小鼠胚胎發(fā)育的研究，可以幫助人們深入認(rèn)識人類胚胎發(fā)育的過程。近年研究發(fā)

2、現(xiàn)，mir-290簇在小鼠著床前胚胎中特異性高表達(dá)，但其對小鼠著床前胚胎發(fā)育的具體作用和調(diào)控機(jī)理仍未闡明。近期數(shù)據(jù)顯示，microRNA可通過靶向自噬相關(guān)基因參與調(diào)控細(xì)胞自噬水平，介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)對饑餓、生長因子缺失、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和病原體感染等應(yīng)激環(huán)境。自噬是細(xì)胞分解代謝的重要生理過程。在胚胎發(fā)育過程中，自噬在卵母細(xì)胞向受精卵轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮了降解母源性物質(zhì)、提供氨基酸能量和維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要作用。有學(xué)者在對小鼠黑色素瘤細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)mir

3、-290簇可靶向作用于自噬相關(guān)基因Atg7和ULK1，抑制腫瘤細(xì)胞的自噬性死亡。但是，在小鼠著床前胚胎發(fā)育過程中，mir-290簇是否可通過自噬相關(guān)基因參與調(diào)控著床前胚胎發(fā)育，其具體作用如何仍然未知。綜上，本研究通過生物信息學(xué)分析，選擇 mir-290簇中的miR-291a/b-5p為研究對象，旨在研究其對自噬相關(guān)基因Atg5和Becn1的作用及自噬的影響，以及其在小鼠著床前胚胎發(fā)育中的作用和相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1、

4、獲取小鼠不同發(fā)育階段著床前胚胎。對4周齡C57BL/6J雌鼠進(jìn)行超數(shù)排卵，與8周齡C57BL/6J公鼠交配，次日早晨檢查陰栓；根據(jù)胚胎發(fā)育時間，在體視顯微鏡下收集不同階段的小鼠著床前胚胎。
　　2、提取小鼠胚胎微量RNA并進(jìn)行Real Time PCR檢測。使用PicoPure? RNA Isolation Kit提取微量胚胎標(biāo)本的RNA，使用SYBR? PrimeScriptTM miRNA RT-PCR Kit試劑盒，對提取的

5、RNA樣品進(jìn)行可同時應(yīng)用于microRNA和mRNA檢測的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，進(jìn)行Real Time PCR檢測。
　　3、小鼠胚胎免疫熒光檢測。胚胎免疫熒光檢測自噬體相關(guān)蛋白LC3B和溶酶體膜蛋白 LAMP，觀察小鼠著床前胚胎不同發(fā)育階段胞漿中自噬體及自噬溶酶體形成的動態(tài)變化。將采集的小鼠胚胎置入1％PFA+0.2%Triton?X-100，室溫放置于暗濕盒中1小時，進(jìn)行同步固定和穿透。在體視顯微鏡下洗胚、封閉、抗體孵育和核復(fù)染。熒光顯

6、微鏡下觀察并照相。
　　4、小鼠胚胎透射電鏡標(biāo)本制備與檢測。在體視顯微鏡下，收集200枚胚胎，移入輸卵管壺腹部，將包埋胚胎樣本的輸卵管轉(zhuǎn)移入預(yù)冷的3%戊二醛中，4℃過夜固定后，進(jìn)行后續(xù)常規(guī)透射電鏡標(biāo)本制備并拍照觀察。
　　5、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)。生物信息學(xué)軟件分析 miR-291a/b-5p對 Atg5和Becn1的靶向序列，構(gòu)建含有靶向結(jié)合序列的報告基因載體，在小鼠胚胎來源的NIH/3T3細(xì)胞中驗(yàn)證miR-291a/b

7、-5p對Atg5和Becn1的靶向作用關(guān)系。
　　6、在NIH/3T3細(xì)胞中過表達(dá)miR-291a/b-5p，western blot檢測其對細(xì)胞中Atg5和Becn1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響；以及對細(xì)胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化的影響；共轉(zhuǎn)染EGFP-LC3和miR-291a-5p，熒光顯微鏡下觀察miR-291a-5p對EGFP-LC3聚集光斑陽性細(xì)胞數(shù)目的影響。
　　7、胚胎顯微注射和體外培養(yǎng)。超數(shù)排卵和交配后，體

8、視顯微鏡下采集C57BL/6J小鼠1-cell期胚胎，對胞漿顯微注射5’FAM修飾的miR-291a-5p inhibitor，將注射后胚胎進(jìn)行體外培養(yǎng)，熒光顯微鏡觀察miR-291a-5p inhibitor在小鼠胚胎早期發(fā)育中的表達(dá)分布，Real Time PCR檢測miR-291a-5p inhibitor對胚胎中miR-291a-5p的抑制效應(yīng)、對Atg5和Becn1 mRNA表達(dá)的作用，以及其對小鼠胚胎早期發(fā)育的影響。

9、　　結(jié)果：
　　1、miR-291a/b-5p和自噬相關(guān)基因Atg5及Becn1在小鼠著床前胚胎中的表達(dá)呈動態(tài)變化。在2~4-cell階段，miR-291a/b-5p表達(dá)升高，而Atg5和Becn1 mRNA的表達(dá)下降，其相互之間的表達(dá)趨勢呈反向的對應(yīng)關(guān)系。
　　2、胚胎免疫熒光監(jiān)測小鼠著床前胚胎中自噬體形成及自噬溶酶體形成的變化。結(jié)果顯示受精后1-cell期胚胎中自噬體及自噬溶酶體形成增加，從2-cell發(fā)育階段開始減少，

10、4~8-cell發(fā)育階段明顯減少。
　　3、胚胎透射電鏡檢測顯示1-cell期受精卵胞漿中出現(xiàn)自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)，而未受精的卵母細(xì)胞胞漿中未觀察到該結(jié)構(gòu)。
　　4、雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-291a/b-5p對Atg5和Becn1具有靶向抑制作用；miR-291a/b-5p可靶向抑制NIH/3T3細(xì)胞中Atg5和Becn1 mRNA和蛋白的表達(dá)；miR-291a-5p可抑制雷帕霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞中 LC3-Ⅰ向 LC3-Ⅱ

11、的轉(zhuǎn)化，減少EGFP-LC3聚集光斑陽性的細(xì)胞數(shù)目。
　　5、小鼠受精卵胞漿顯微注射5’FAM修飾的miR-291a-5p inhibitor，熒光顯微鏡下miR-291a-5p inhibitor均勻分布于胚胎胞漿，且隨著胚胎分裂而進(jìn)一步分布于各個卵裂球中，至注射后48 h觀察，仍可見綠色熒光。注射miR-291a-5p inhibitor后，胚胎中 miR-291a-5p表達(dá)顯著低于各對照組，Becn1 mRNA表達(dá)顯著高于各

12、對照組，Atg5 mRNA表達(dá)顯著高于Scramble inhibitor對照組。胚胎在1-cell階段向2-cell階段的發(fā)育率均高于各對照組，在4.5dpc的囊胚形成率顯著高于Control對照組。
　　結(jié)論：
　　1、miR-291a/b-5p作為mir-290簇的成熟microRNA分子，在小鼠著床前胚胎中的表達(dá)呈動態(tài)變化，其表達(dá)趨勢在小鼠胚胎2~4-cell發(fā)育階段與自噬相關(guān)基因 Atg5和Becn1 mRNA呈反