HIV快速進展者NK細胞microRNA表達譜全篩、驗證及靶mRNA預測.pdf

1、目的：
　　人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immune defiency syndrome，AIDS)即艾滋病的病原體。HIV感染后感染者的疾病進程存在較大差異，研究影響HIV疾病進程的因素及生物學標志，將會對艾滋病治療、免疫調節(jié)和疫苗研究具有重要意義。
　　自然殺傷細胞(natural killer cells，NK cells

2、)是天然免疫系統(tǒng)的主要組成部分，對病毒感染細胞和腫瘤細胞均發(fā)揮著重要的殺傷作用，其免疫應答早于獲得性免疫，是機體的第一道防線。目前研究表明，HIV感染的疾病進程取決于感染早期的免疫應答情況[1]，因此，在感染早期就發(fā)揮作用的NK細胞越來越受到人們的關注。國際上的研究和我們課題組的報道亦證明，NK細胞的功能與HIV疾病進程密切相關。
　　microRNA(miRNA，miR)是生物體內源性的長度約為21-25個核苷酸的單鏈非編碼小R

3、NA，通過與靶mRNA形成完全或不完全互補配對，在轉錄后水平對基因表達調控有重要影響。miRNA通過調控轉錄相關蛋白和信號通路中的關鍵分子，進而調控著細胞的發(fā)育和功能應答。研究表明miRNA能夠調節(jié)NK細胞的發(fā)育和功能應答。在HIV感染過程中，NK細胞功能的變化是否受到miRNA的調控？HIV感染是否可引起某些miRNA的變化，進而影響NK細胞的功能，導致HIV疾病進程不同？目前HIV感染者miRNA研究主要集中在外周血單個核細胞(Pe

4、ripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)，關于HIV感染者NK細胞miRNA的研究還未見報道。
　　本研究采用流式細胞分選技術分選出HIV典型進展者(typical progressors，TPs)、快速進展者(rapid progressors，RPs)感染早期（120天）NK細胞以及健康對照者NK細胞，采用實時定量PCR技術進行NK細胞miRNA表達譜(510種）全篩檢測及驗證檢測，并對miR

5、NA靶mRNA進行預測，以探索HIV感染對NK細胞miRNA的影響，以及miRNA水平對HIV疾病進程的影響。
　　材料與方法：
　　1、研究對象
　　本研究選取37例未經(jīng)過高效抗病毒治療（High active antiretroviral therapy,HAART）的HIV早期感染者（early HIV infection，EHI），以及5例HIV血清抗體檢測陰性的健康者（HIV negative control

6、，HNC）。HIV早期感染的定義符合國際標準[20]。37例EHI被分到2組，即快速進展者組（RP組）（感染一年后CD4+T細胞數(shù)量＜350 cells/μl）和典型進展者組（TP組）(感染一年后CD4+T細胞數(shù)量≥500 cells/μl)。所有HIV感染者NK細胞miRNA采樣時間均為HIV感染120天。在miRNA全篩研究階段（miRNA training group），我們對5例RP，5例TP及5例HNC的NK細胞510種miR

7、NA進行檢測。只有在RP組和TP組表達含量有明顯差異（即P＜0.05）的miRNA才能進入miRNA驗證檢測研究階段(miRNAvalidation group)。在miRNA驗證研究階段，我們選取11例RP和16例TP進行研究。37例HIV感染者均來自中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診確診HIV感染的男男性接觸人群。5例HIV血清抗體檢測陰性的健康人，符合以下標準:HIV抗體陰性，血常規(guī)及肝腎功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰

8、性，無免疫系統(tǒng)疾病，未暴露于HIV的正常人。所有研究對象都簽署了知情同意書。
　　2、CD4+T細胞絕對計數(shù)、NK細胞絕對計數(shù)
　　(1) CD4+T淋巴細胞絕對計數(shù)
　　應用流式細胞儀FACSCalibur，MULTISET軟件檢測外周全血并進行自動分析，計算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細胞絕對值及相應比值。
　　(2) NK細胞絕對計數(shù)
　　應用流式細胞儀FACSCalibur，MULTISET軟

9、件檢測外周全血并進行自動分析，計算NK細胞絕對值及相應比值。
　　3、病毒載量的檢測
　　采用Roche公司COBAS(R) AMPLICOR HIV-1 MONITORTM Test, Version1.5試劑盒在COBAS(R)TaqMan(R)系統(tǒng)進行全自動PCR反應體系制備及病毒載量檢測。
　　4、NK細胞分選及純度檢測
　　復蘇液氮凍存的PBMC樣本，離心400g，4℃，10分鐘。離心結束后棄上清，將復

10、蘇的PBMC轉移到流式管內。用TriTEST CD3 FITC/CD16+56 PE/CD45 PerCP試劑進行細胞表面染色，注意避光，4℃，30分鐘。染色結束，洗去未結合染料，加入3ml/管無菌PBS，離心350g，4℃，5分鐘。離心結束后棄上清，加入1.5ml無菌PBS，混勻細胞。PBMC樣本在流式細胞分選儀FACSAriaⅡ進行分選，分選出NK細胞并進行純度檢測。
　　5、NK細胞miRNA表達量的檢測
　　(1)總

11、RNA的分離
　　用預冷的PBS清洗細胞并計數(shù)，300g離心10min收集細胞樣本;小心吸取出PBS后，加入650μl Lysis Buffer;渦旋振蕩使細胞完全裂解。按照細胞與組織TotalRNA提取試劑操作說明書標準方法提取總RNA。
　　(2) miRNA反轉錄生成cDNA
　　首先在miRNA的3'尾部添加Poly A(A-Plus)，然后cDNA鏈的合成(RT-PCR)。全部操作按照Quanto-miR c

12、DNA合成試劑操作說明書的標準方法進行。
　　(3) qPCR反應
　　miRNA反轉錄生成cDNA進行qPCR反應。全部特異性引物均來自microRNAprimer system（北京曠博生物技術有限公司，中國）。全部操作按照Quanto-miR檢測試劑說明書進行，采用2-△△CT方法，檢測miRNA的表達水平。
　　6、靶mRNA預測及Pathway enrichment分析
　　用miRecords（htt

13、p://mirecords.biolead.org/）進行miRNA的靶mRNA基因預測。從結果中選擇至少有3種算法能共同預測出的靶基因。然后將這些靶基因通過GeneGO MetacoreTM軟件進行Pathway enrichment分析，設置P＜0.05。
　　7、統(tǒng)計學分析
　　用SPSS17.0統(tǒng)計軟件及GraphPad Prism5.0軟件進行統(tǒng)計分析。TP組，RP組及HNC組各組患者的基本信息、免疫學指標及病毒載

14、量的比較，分類變量采用卡方檢驗，連續(xù)型變量采用獨立樣本t檢驗，非參數(shù)變量采用Mann-Whitney U檢驗。miRNA的表達水平與免疫學指標和病毒載量間的相關性分析采用Spearman秩相關檢驗。不同組間miRNA表達水平的差異用Mann-Whitney U檢驗分析。HIV感染者的血漿病毒載量用自然對數(shù)(log10)表示。受試者工作特征曲線(Receiveroperating characteristic curve，ROC curv

15、e)用來評價NK細胞miRNA表達水平預測疾病進程的診斷價值。Kaplan-Meier生存分析來分析感染早期NK內miRNA表達不同高低水平患者的生存情況。P＜0.05認為有統(tǒng)計學差異。
　　實驗結果：
　　一、HIV感染者的基本情況
　　HIV感染者CD4+T細胞絕對數(shù)、NK細胞絕對數(shù)及百分比均低于健康對照者。通過Loess曲線擬合觀察到快速進展者CD4+T細胞絕對數(shù)及NK細胞絕對數(shù)持續(xù)高于典型進展者，病毒載量持續(xù)低

16、于典型進展者。
　　二、NK細胞分選純度及總R隊質量評估
　　所有研究對象NK細胞分選純度均在99％以上。從RNA濃度、A260/A280以及qPCR擴增實驗來看，所有樣本的RNA都成功提取，且cDNA質量也均通過質控。
　　三、HIV感染者NK細胞miRNA全篩結果
　　1、HIV感染者(HIV組)和健康對照者(HNC組)NK細胞miRNA差異表達
　　與HNC組相比，HIV組NK細胞miRNA大多數(shù)表達

17、含量下降，有41種miRNA相對含量顯著下降，6種miRNA相對含量顯著升高（P＜0.05）。
　　2、TP組與HNC組NK細胞miRNA差異表達
　　與HNC組相比，TP組有14種miRNA相對含量顯著下降，6種miRNA相對含量顯著升高(P＜0.05)。
　　3、RP組與HNC組NK細胞miRNA差異表達
　　與HNC組相比，RP組有71種miRNA相對含量顯著下降，12種miRNA相對含量顯著升高（P＜0.

18、05）。
　　4、TP組和RP組NK細胞miRNA差異表達
　　與TP組相比，RP組NK細胞有30種miRNA相對含量顯著下降，有12種miRNA相對含量顯著升高(P＜0.05)。共計有顯著差異變化的miRNA42種。
　　四、HIV感染者NK細胞miRNA驗證研究結果
　　1、TP組與RP組驗證研究結果
　　擴大樣本（TP組11例，RP組16例），對篩選到的影響HIV疾病進程的42種miRNA進行驗證檢測

19、。結果顯示:miR-302d相對含量在RP組顯著升高(P=0.00058)。
　　2、miR-302d的相對含量與CD4、病毒載量的相關性分析
　　miR-302d相對含量與患者感染早期（120天）、感染1年后CD4+T細胞絕對數(shù)均呈顯著負相關性（P=0.0008，r=-0.6087; P=0.0002，r=-0.6656），但是與病毒載量無相關性。
　　3、ROC曲線分析miR-302d相對含量對HIV疾病快速進展的

20、預測作用
　　ROC曲線分析顯示，HIV感染早期NK細胞miR-302d的相對含量對預測HIV疾病快速進展有高準確性（P=0.00046，AUC=0.903）。
　　4、miR-302d相對含量不同的HIV感染者疾病進展的生存分析
　　將CD4+T細胞絕對數(shù)＜350cells/μl，病毒載量＞104.5copies/ml作為結局事件，進行Kaplan-Meier生存分析，我們發(fā)現(xiàn):miR-302d相對含量高的HIV感染

21、者(“≥median”組)CD4+T細胞數(shù)量下降速率快(P=0.0002，log-rank x2=13.68)，病毒載量的下降速率無統(tǒng)計學差異。
　　5、miR-302d相對表達量與NK細胞數(shù)量分析
　　miR-302d相對含量與HIV感染早期（120天）、感染1年后NK細胞數(shù)量及百分比均無相關性。提示miR-302d是通過影響NK細胞功能，進而影響HIV疾病進程。
　　五、miR-302d靶mRNA預測分析結果

22、>　　通過軟件分析，預測了miR-302d靶mRNA基因，其主要在WNT signalingpathway， FAS signaling cascades，Granzyme B signaling pathway等信號通路中富集。推測在HIV早期感染時，miR-302d可能抑制發(fā)揮殺傷功能的mRNA表達，使殺傷功能下降，進而影響隨后的疾病進程。
　　結論：
　　1、通過miRNA全篩研究發(fā)現(xiàn)，與典型進展者相比，快速進展者有3