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文檔簡介
1、目的:構(gòu)建骨形成蛋白-7(BMP7)腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒pAAV-hBMP7-IRESZsGreen和SOX9腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato并進行腺相關(guān)病毒包裝,體外共同轉(zhuǎn)染人椎間盤細胞評價其生物學(xué)效應(yīng)。
方法:用分子克隆技術(shù)從質(zhì)粒pUC57-hBMP-7獲得BMP-7cDNA并克隆至AAV包裝質(zhì)粒pAAV-IRES-ZsGreen上,構(gòu)建成pAAV-hBMP7-IRES-ZsGreen的
2、AAV重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切及測序鑒定后,由深圳百恩維公司對pAAV-hBMP7-IRES-ZsGreen進行包裝;同法獲得SOX9過表達腺相關(guān)病毒pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato的包裝;AAV-BMP-7與AAV-SOX9聯(lián)合轉(zhuǎn)染人退變的椎間盤纖維環(huán)細胞,Westernblotting檢測BMP-7與SOX9蛋白表達以及髓核細胞Ⅱ型膠原表達量的變化。
結(jié)果:經(jīng)酶切鑒定及基因測序證實AAV包裝質(zhì)粒pAAV-hBM
3、P7-IRES-ZsGreen與pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato構(gòu)建完成,熒光免疫組化顯示BMP-7與SOX9蛋白表達,百思維公司包裝出具有生物學(xué)功能的AAV-BMP-7,AAV-SOX9構(gòu)建成功。Westernblotting顯示BMP-7與SOX9在纖維環(huán)細胞中表達,AAV-BMP-7與AAV-SOX9雙基因聯(lián)合轉(zhuǎn)染的纖維環(huán)細胞Ⅱ型膠原表達量明顯較AAV-BMP-7與AAV-SOX9基因轉(zhuǎn)染的細胞Ⅱ型膠原表達量多。<
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