重組減毒沙門(mén)氏菌鴨瘟病毒DNA疫苗的構(gòu)建及其口服免疫效果研究.pdf

1、本論文以質(zhì)粒pVAX1和pGL3-control為基礎(chǔ)，輔以重要元件(CpG免疫基序、核靶向序列、asd基因等)，利用類(lèi)生物學(xué)合成方法構(gòu)建出一種新穎的通用型DNA疫苗載體，命名為pkDNA。酶切連接綠色熒光蛋白基因(egfp)體外轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞證實(shí)該質(zhì)粒具有pVAX1相似的真核表達(dá)能力。選取鴨瘟病毒gB糖蛋白膜外區(qū)域編碼基因和UL24基因?yàn)榭乖?，大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(E.coli LTB)基因和鴨IL-2mRNA反轉(zhuǎn)錄c

2、DNA為分子佐劑構(gòu)建多種鴨瘟病毒DNA疫苗質(zhì)粒。以c8276△crp/cya（鼠傷寒沙門(mén)氏菌UK-1△asd△crp△cya缺失株）為口服免疫途徑遞送活菌載體，20日齡麻鴨口服免疫重組減毒沙門(mén)氏菌鴨瘟病毒DNA疫苗兩次，均能產(chǎn)生較高的體液及粘膜免疫應(yīng)答，并在一定程度上抵抗鴨瘟病強(qiáng)毒株的挑戰(zhàn)，其中c8276△crp/cya(pkDNA-UL24-LTB)組效果顯著。結(jié)果如下:
　　一種新穎通用型DNA疫苗載體的構(gòu)建:利用類(lèi)生物學(xué)合成

3、方法合成全新DNA疫苗載體pkDNA:以UK-1基因組、pVAX1和pGL3-control為模板PCR擴(kuò)增獲得基因片段asd、pUC、CMVMCS、BGH poly(A)、SV40 enhancer和SV40 late poly(A)片段;重疊PCR兩兩融合構(gòu)建三模塊片段:(1/2DTSⅡ+asd+CpG+PUC)、(BGH polyA+CpG+SV40 enhancer)和(MVMCS+CpG+SV40 polyA+1/2DTSⅡ)

4、;最后利用GibsonAssembly(@) Master Mix(New England Biolabs(@)inc.)完成pkDNA質(zhì)粒的類(lèi)生物合成。兩次測(cè)序結(jié)果表明與理論序列相符，酶切連接綠色熒光蛋白基因（egfp），直接熒光法可見(jiàn)綠色熒光蛋白在COS-7細(xì)胞中很好的表達(dá)，其真核表達(dá)能力與pVAX1相似。
　　鴨瘟病毒DNA疫苗的構(gòu)建及其體外表達(dá)能力檢測(cè):PCR擴(kuò)增tgB(451-1650bp)、UL24、LTB、和鴨IL-

5、2基因;重疊PCR擴(kuò)增得到UL24-LTB、UL24-DuIL2融合片段。單抗原基因及融合基因酶切連接pkDNA，完成鴨瘟病毒DNA疫苗質(zhì)粒:pkDNA-tgB、pkDNA-UL24、pkDNA-UL24-LTB、pkDAN-UL24-DuIL2，測(cè)序鑒定無(wú)誤。所有DNA疫苗質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，間接免疫熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染24小時(shí)后的細(xì)胞，均可見(jiàn)強(qiáng)烈的綠色熒光信號(hào)，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及空白組熒光不明顯;48小時(shí)后，收集細(xì)胞，提取總RNA，R

6、T-PCR檢測(cè)可見(jiàn)pkDNA-UL24-LTB和pkDNA-UL24-DuIL2轉(zhuǎn)染組中佐劑基因特異性轉(zhuǎn)錄。
　　c8276△crp/cya弱毒株及重組減毒沙門(mén)氏菌鴨瘟病毒DNA疫苗菌株的構(gòu)建:以鼠傷寒沙門(mén)氏菌c8276(UK-1△asd)△crp缺失株為親本構(gòu)建c8276△crp/cya弱毒株，經(jīng)PCR及麥康凱（麥芽糖+）平板鑒定表明突變株構(gòu)建成功。鴨瘟病毒DNA疫苗質(zhì)粒電轉(zhuǎn)c8276△crp/cya，獲得系列重組沙門(mén)氏菌鴨瘟病

7、毒DNA疫苗菌株:c8276△crp/cya(pkDNA-tgB)、c8276△crp/cya(pkDNA-UL24)、c8276△crp/cya(pkDNA-UL24-LTB)、c8276△crp/cya(pkD AN-UL24-DuIL2),c8276△crp/cya(p VAX1-UL24)及c8276△crp/cya(pkDNA); LB平板上連續(xù)劃線培養(yǎng)20代，PCR鑒定顯示DNA疫苗質(zhì)粒在c8276△crp/cya中遺傳穩(wěn)定

8、性良好，且不影響菌株生長(zhǎng);7日齡麻鴨口服接種高達(dá)1012 CFUc8276△crp/cya(pkDNA)，兩周內(nèi)小鴨食欲飲欲正常，剖檢各器官組織無(wú)任何病癥現(xiàn)象，重組疫苗安全性良好。
　　重組減毒沙門(mén)氏菌鴨瘟病毒DNA疫苗免疫效果研究:20日齡麻鴨隨機(jī)分成7組，記為A-G: A.c8276△crp/cya(pkD NA-UL24)、B.c8276△crp/cya(pkDNA-UL24-LTB)、C.c8276△crp/cya(pkD

9、 AN-UL24-DuIL2)、D.c8276△crp/cya(pkDNA-tgB)+c8276△crp/cya(pkDNA-UL24)、E.c8276△crp/cya(pVAX1-UL24)、F.c8276△crp/cya(pkDNA)及G.BSG組，每組15只，每只口服免疫1012CFU重組疫苗菌株，共免疫兩次，每次間隔2周。一免后第10天、21天和28天每組隨機(jī)挑選6只采集血清，一免后第21天，每組隨機(jī)選取5只采集膽汁及十二指腸粘

10、液，分別檢測(cè)針對(duì)tUL24蛋白及DEV病毒顆粒的抗體應(yīng)答水平，二免兩周后DEV強(qiáng)毒株CHv經(jīng)口攻毒檢測(cè)疫苗保護(hù)力水平。結(jié)果顯示:B組誘導(dǎo)最高的膽汁IgA抗體水平(P＜0.05)，B組和C組產(chǎn)生的血清IgY抗體水平高于其他組(P＜0.05)，D組麻鴨產(chǎn)生更高的抗DEV的抗體水平比起抗tUL24;所有實(shí)驗(yàn)組(A-D)和陽(yáng)性對(duì)照E組產(chǎn)生的抗體水平顯著性高于F和G組(P＜0.01);攻毒12天后B組存活率最高(9/10)，D組隨之7/10，C與