幽門(mén)螺桿菌Tipα蛋白經(jīng)C23-NF-κB途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-8.pdf

1、目的：
　　觀察幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白（Tipα）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α和IL-8的分子機(jī)制。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞系 THP-1，用佛波脂（PMA）誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞后，采用30～200μg/ml的Tipα刺激4h，實(shí)時(shí)定量PCR（real time PCR）檢測(cè)核仁素（C23）和Toll樣受體4（TLR4）mRNA的表達(dá)；分別采用C23和

2、TLR4 siRNA干擾巨噬細(xì)胞后，觀察其對(duì)Tipα誘導(dǎo)TNF-α和IL-8的影響；采用5μg/mL衣霉素預(yù)處理細(xì)胞抑制N-糖鏈合成，隨后用Tipα刺激24h，觀察其對(duì)TNF-α和IL-8分泌的影響；分別采用 C23和Tipα抗體沉淀蛋白，隨后分別采用 Tipα和C23抗體行Western blot分析；采用C23 siRNA干擾其表達(dá)后，Western blot分析IκB表達(dá)水平以及細(xì)胞核中p65含量；采用蛋白酶體抑制劑MG-132處

3、理細(xì)胞，ELISA檢測(cè)其對(duì)TNF-α和IL-8的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)Real time PCR結(jié)果顯示，30～200μg/ml Tipα處理巨噬細(xì)胞4h后，C23的mRNA水平明顯增高，且隨著Tipα劑量的增加，mRNA表達(dá)水平有增高的趨勢(shì)。TLR4 mRNA水平在Tipα處理前后無(wú)明顯變化；
　　(2)ELISA結(jié)果顯示C23 siRNA轉(zhuǎn)染后，Tipα刺激后TNF-α和IL-8顯著降低，而TLR4 siR

4、NA轉(zhuǎn)染對(duì)TNF-α和IL-8分泌無(wú)明顯影響；
　　(3)5μg/ml衣霉素預(yù)處理8h后，ELISA結(jié)果顯示Tipα刺激后TNF-α和IL-8明顯低于未處理組；
　　(4)采用C23抗體沉淀蛋白后，可檢測(cè)到明顯的Tipα條帶。同時(shí)，預(yù)先使用Tipα抗體沉淀蛋白，也可檢測(cè)出C23條帶；
　　(5)Tipα處理巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)IκB水平明顯降低。C23 siRNA干擾其表達(dá)后，IκB降解受到抑制；Tipα可增加細(xì)胞核內(nèi)p