CaN信號通路調(diào)控白念珠菌基因RTA2的表達機制及功能研究.pdf

1、白念珠菌耐藥是抗真菌治療失敗的主要原因，白念珠菌鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CAN)通路與耐藥性產(chǎn)生密切相關，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)RTA2基因是CaN通路調(diào)節(jié)白念珠菌對唑類藥物的耐藥性產(chǎn)生的必需基因，但RTA2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制目前尚不清楚。本課題首先利用基因敲除方法構建RTA2基因在白念珠菌CNA(CaN催化亞單位編碼基因)缺失菌DSY2101(()/()cna)和CRZ1(CaN通路轉(zhuǎn)錄因子Crzlp編碼基因)缺失菌DSY2195(()/()crzl

2、)中的缺失菌DJY201(()/()cna()/()rta2)、MJY201(()/()crzl()/()rta2)。然后利用微量液基稀釋法考察了在白念珠菌CAF2-1(野生菌)、DSY2091(()/()cna)、DJY201(()/()cna()/()rta2)、DSY2115(CNA回復菌)、DSY2195(()/()crzl)、MJY201(()/()crzl()/()rta2)和MKY268(CRZ1回復菌)中，加入細胞外鈣離

3、子對氟康唑的抗真菌活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在白念珠野生型菌CAF2-1中，加入2.5 mmol/L CaCl2能夠顯著降低氟康唑的抗真菌活性(MIC80從0.5μg/ml增加到64μg/ml)；在DSY2091、DJY201、DSY2195和MJY201中，加入2.5 mmol/LCaCl2對氟康唑的抗真菌活性幾乎沒有影響；在CNA回復菌DSY2115和CRZ1回復菌MKY268中，加入2.5mmol/L CaCl2又能夠顯著降低氟康唑的

4、抗真菌活性(MIC80從0.5μg/ml增加到16μg/ml和64μg/ml)，證明RTA2基因是CaN通路調(diào)節(jié)白念珠菌對唑類藥物的耐藥性產(chǎn)生的靶基因。 本課題又利用報告基因法研究RTA2基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。首先設計引物，利用Pyrobest高保真酶PCR擴增報告基因RLUC，并與白念珠菌ACT1基因的終止片段融合，克隆到質(zhì)粒pBES116，得到載體pBES-RLUC-ACT1，然后再利用Pyrobest高保真酶PCR擴增RTA

5、2起始密碼子上游973bp、785bp、455bp、440bp和274bp序列，分別克隆到載體pBES-RLUC-ACT1，得到的報告基因載體分別命名為pBES-R1、2、3、4、5，分別轉(zhuǎn)化CRZ1缺失菌和RTA2缺失菌后，利用CaCl2激活CaN信號轉(zhuǎn)導通路，提取蛋白，加入RLUC的底物coelentrazine，測定RLUC的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CRZl缺失菌轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pBES-RTA1，2-5轉(zhuǎn)化子的報告基因RLUC的活性低，證明RT