與ZNF446同源的LT-7在布魯菌侵染THP-1中對(duì)MAPK通路影響的研究.pdf

1、目的：布?。˙rucellosis）是一種嚴(yán)重危害人和動(dòng)物健康的人獸共患傳染病。巨噬細(xì)胞是布魯菌生存和繁殖的靶細(xì)胞之一，布魯菌的胞內(nèi)生存與抑制宿主細(xì)胞凋亡有關(guān)，外膜蛋白 OMP25(Outer Membrane Protein25)在布魯菌的毒力及胞內(nèi)寄生中起重要作用。前期，本課題組應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)篩選出與布魯菌OMP25特異性結(jié)合的42個(gè)環(huán)形七肽，通過生物信息學(xué)分析，LT-7C與鋅指蛋白ZNF446（Zinc Finger Prot

2、ein Peptide446）對(duì)應(yīng)區(qū)域有100％的同源性。本研究以布魯菌RB51(Brucella abortus strain RB51)侵染THP-1(human leukemia cell line)細(xì)胞，研究LT-7C在不同階段對(duì)MAPK通路(MAPK signal pathway)的影響，進(jìn)而探討LT-7C對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。
　　方法：
　　本研究利用合成的環(huán)形七肽與THP-1共孵育，采用MTT法進(jìn)行多肽的毒性檢測(cè)

3、，選擇合適的七肽濃度與THP-1共孵育，實(shí)驗(yàn)設(shè)未感染組和感染組，包括未感染對(duì)照組、未感染線性七肽組、未感染環(huán)形七肽組、感染對(duì)照組、感染線性七肽組和感染環(huán)形七肽組。以MOI(multiplicity of infection)為50:1建立RB51感染THP-1細(xì)胞的感染模型。分別收集4、8、12、24h和48h的感染細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同時(shí)間段的早期凋亡率；感染4h和48h時(shí)，曲拉通裂解細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)布魯菌計(jì)數(shù)；采用qRT-PC

4、R技術(shù)和Western blot檢測(cè)4h和48h MAPK通路中ERK1/2、JNK1/2、P38的mRNA水平和蛋白的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　(1)合成的環(huán)形七肽對(duì)THP-1無(wú)毒副作用；
　　(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示：在未感染組中環(huán)形七肽組和線性七肽組與對(duì)照組比較早期凋亡率隨著時(shí)間的變化呈上升趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在感染組中環(huán)形七肽組和線性七肽組與感染對(duì)照組比較12h前呈上升趨勢(shì)，

5、12h后呈下降趨勢(shì)，其中4h時(shí)感染環(huán)形組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；48h時(shí)感染環(huán)形組低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　(3)CFU計(jì)數(shù)結(jié)果顯示感染環(huán)形七肽組早期4h時(shí)胞內(nèi)細(xì)菌量低于感染對(duì)照組，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；線性七肽組4h胞內(nèi)含菌量高于感染對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；48h時(shí)各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(4) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示4h時(shí)感染線性組LT-7組和感染

6、環(huán)形LT-7C組erk1的拷貝數(shù)低于感染對(duì)照組，ekr2、p38、jnk1和jnk2拷貝數(shù)在各感染組無(wú)變化，未感染組4h時(shí)各基因的拷貝數(shù)無(wú)變化；48h時(shí)感染環(huán)形組中jnk1/2拷貝數(shù)低于感染對(duì)照組；erk1、ekr2、p38拷貝數(shù)在各感染組無(wú)變化，未感染組48h時(shí)各基因的拷貝數(shù)無(wú)變化；
　?。?）Western blot結(jié)果與qRT-PCR一致。
　　結(jié)論：
　　(1)以MOI為50:1的RB51感染的環(huán)形七肽組中，環(huán)