菲律賓蛤仔附著變態(tài)過(guò)程中的差異基因表達(dá)與基因克隆.pdf

1、菲律賓蛤仔(RuditapesphilippinarumAdamsetReeve)又稱蛤仔，廣泛分布在我國(guó)黃、渤海海區(qū)，其肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，為我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一，是捕撈和人工養(yǎng)殖的對(duì)象。隨著人們生活水平的日益提高，市場(chǎng)對(duì)該貝苗種的需求亦日益增加。附著變態(tài)過(guò)程是貝類生活史中的關(guān)健時(shí)期，是幼蟲(chóng)向成體轉(zhuǎn)變的重要環(huán)節(jié)。蛤仔苗種的產(chǎn)量和質(zhì)量在很大程度上取決于幼苗的附著變態(tài)過(guò)程，幼苗附著變態(tài)的成功與否往往決定著出苗量和育苗的成敗。因此研究其受精

2、生物學(xué)、胚胎發(fā)生、附著、變態(tài)等基礎(chǔ)生物學(xué)的工作已引起科研工作者的重視，然而從分子水平方面闡明附著變態(tài)機(jī)理的研究還不太深入。本論文以菲律賓蛤仔附著變態(tài)時(shí)期的幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，采用分子生物學(xué)技術(shù)，試圖從分子水平上找出與菲律賓蛤仔附著變態(tài)及發(fā)育相關(guān)的基因，為貝類幼苗發(fā)育生物學(xué)，生理學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展提供參考，同時(shí)為苗種業(yè)的開(kāi)發(fā)提供一定的基礎(chǔ)理論依據(jù)。主要結(jié)果如下：1.采用DDRT-PCR技術(shù)，以受精后殼頂前期、殼頂期、眼點(diǎn)期、稚貝期的菲律賓蛤

3、仔幼蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究菲律賓蛤仔幼蟲(chóng)不同發(fā)育時(shí)期的基因表達(dá)，進(jìn)而找出與菲律賓蛤仔附著變態(tài)相關(guān)的基因。 2.研究了腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺、γ-氨基丁酸、KCl和CaCl2，在不同劑量和不同的誘導(dǎo)持續(xù)時(shí)間下，對(duì)菲律賓蛤仔眼點(diǎn)幼蟲(chóng)附著變態(tài)的誘導(dǎo)作用。在此基礎(chǔ)之上，選取出最佳而又經(jīng)濟(jì)的神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)腎上腺素(使用濃度為10-6M，誘導(dǎo)時(shí)間為4h)，同樣也采用DDRT-PCR技術(shù)，6組引物組合，擴(kuò)增出343條帶，67條具有明顯表達(dá)

4、差異，其中的18條在對(duì)照組中有高表達(dá)，而另外的49條差異帶在實(shí)驗(yàn)組中有高表達(dá)，表明這些差異帶所代表的基因都和腎上腺素誘導(dǎo)有關(guān)，同時(shí)也從分子生物學(xué)水平上證明了腎上腺素參與了貝類附著變態(tài)機(jī)理的調(diào)控過(guò)程。 3.以菲律賓蛤仔眼點(diǎn)幼蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)材料，應(yīng)用RACE技術(shù)，克隆了菲律賓蛤仔的replacementhistoneH3.3的全長(zhǎng)cDNA序列(AY916800);菲律賓蛤仔H3.3的基因組序列擴(kuò)增結(jié)果表明：序列L[AY916802]大小為

5、1214bp，含有一個(gè)長(zhǎng)803bp的內(nèi)含子;另一序列S[AY916803]長(zhǎng)約411bp，不具有內(nèi)含子。序列L和S編碼和H3.3完全相同蛋白質(zhì)序列，這表明菲律賓蛤仔的H3.3cDNA可能有多個(gè)序列編碼，也可能序列L為菲律賓蛤仔的H3L-like序列。在這個(gè)研究中，我們還克隆了菲律賓蛤仔的組蛋白H3基因序列，分析表明H3和H3.3編碼的蛋白質(zhì)序列只有四個(gè)氨基酸的差異，表明H3和H3.3及H3L-like存在著密切的關(guān)系，因此我們對(duì)它們特殊

6、進(jìn)化地位及復(fù)制依賴性的組蛋白和復(fù)制不依賴的組蛋白進(jìn)化起源進(jìn)行了討論。本研究支持histoneH3.3為H3的祖先基因的觀點(diǎn)，但我們認(rèn)為H3L-1ike可能是組蛋白基因進(jìn)化過(guò)程中的過(guò)渡基因，而非祖先基因。原位雜交實(shí)驗(yàn)表明H3.3在外套膜及鰓的特異性部位都有較大量的表達(dá)，后期正在進(jìn)行菲律賓蛤仔不同發(fā)育時(shí)期的胚胎及其它組織和器官的原位雜交實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建pGEX-4T-H3.3表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化原核生物DH5α受體菌后，在蛋白上清液中得到很好的表達(dá)，W