豬鏈球菌2型cps2E基因缺失株構(gòu)建及生物學(xué)特性研究.pdf

1、豬鏈球菌病是由豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)感染引起的人畜共患疾病，不僅對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大沖擊，而且嚴(yán)重威脅人類的公共健康。在中國(guó)，1998年和2005年先后暴發(fā)兩次人感染豬鏈球菌的疫情，這引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該病的廣泛關(guān)注。已知豬鏈球菌通過破壞宿主的上皮屏障進(jìn)入血液，進(jìn)而侵襲不同的器官使宿主患病。該菌主要引起豬的急性敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、急性死亡等，在人體中則會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌性腦膜炎和鏈球菌中毒性休克綜合征

2、等疾病。豬鏈球菌血清型眾多，其中豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype 2，S.suis2)是主要的病原菌，具有毒力強(qiáng)、流行廣、臨床分離率高的特點(diǎn)。
　　近年來，對(duì)S.suis2致病機(jī)理及毒力因子的研究表明，莢膜多糖(Capsular Polysaccharide，CPS)是該病原菌公認(rèn)的毒力因子之一。Smith等已經(jīng)獲得了合成豬鏈球菌2型CPS的基因簇，Van Calsteren也初步預(yù)測(cè)了該基因簇

3、編碼的蛋白在CPS重復(fù)單元合成中的酶促功能。盡管如此，尚缺少實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)這些基因的具體功能。因此，為了加深對(duì)豬鏈球菌2型CPS在其致病過程中所發(fā)揮的作用以及多樣性和進(jìn)化的了解，進(jìn)一步研究豬鏈球菌2型CPS生物合成的相關(guān)基因是必需的。
　　Yother預(yù)測(cè)肺炎鏈球菌2型的Cps2E蛋白在其Wzx/Wzy依賴的CPS生物合成途徑中發(fā)揮著起始糖基轉(zhuǎn)移酶的作用。此外，Smith等經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)S.suis2的cps2E基因具有較高的2型特異

4、性。因此本研究選取S.suis2的CPS生物合成相關(guān)基因cps2E，主要研究該基因在CPS生物合成中的功能，并為其他CPS合成相關(guān)基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。本文主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.豬鏈球菌2型cps2E基因生物信息學(xué)分析:
　　將S.suis的3株代表性菌株SC84、05ZYH33及P1/7的CpsE蛋白序列與不同種屬細(xì)菌來源的相應(yīng)蛋白進(jìn)行同源比對(duì)及親緣關(guān)系分析。結(jié)果表明:S.suis的SC84菌株CpsE蛋白質(zhì)序列與

5、05ZYH33、P1/7菌株的一致性分別高達(dá)98％和100％，具有同源性;同時(shí)，S.suis的CpsE蛋白與肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌之間的親緣關(guān)系相近。
　　2.cps2E基因缺失突變株Δcps2E的構(gòu)建:
　　根據(jù)S.suis2菌株05ZYH33全基因組序列(Accesion No.:NC_009442)設(shè)計(jì)引物，其中cps2E的基因位點(diǎn)為SSU05_0568。以S.suis2四川分離菌株SC19的基因組為模板進(jìn)行重疊延伸P

6、CR擴(kuò)增，獲得cps2E基因上下游同源臂的連接產(chǎn)物。將擴(kuò)增產(chǎn)物與pSET4s穿梭質(zhì)粒載體分別雙酶切處理后進(jìn)行連接，最終獲得重組質(zhì)粒pSET4s-Δcps2E，經(jīng)PCR擴(kuò)增及雙酶切鑒定成功。
　　將獲取的重組質(zhì)粒pSET4s-Δcps2E電轉(zhuǎn)化到野生菌株SC19的感受態(tài)細(xì)胞中。進(jìn)而利用pSET4s質(zhì)粒的溫敏性、壯觀霉素抗性及同源重組原理篩選獲得cps2E基因缺失突變株。菌株經(jīng)PCR擴(kuò)增及測(cè)序證實(shí)S.suis2的cps2E基因缺失突變

7、株Δcps2E構(gòu)建成功。
　　3.突變株Δcps2E生物學(xué)性狀分析:
　　將獲得的cps2E基因缺失突變株Δcps2E與野生菌株SC19于37℃進(jìn)行生長(zhǎng)特性分析。繼而分別將突變株Δcps2E與野生菌株SC19腹腔接種4周齡BALB/c雌性小鼠后，再經(jīng)2次腹腔液轉(zhuǎn)種，分離純化血中的細(xì)菌。然后對(duì)分離后的兩種菌株進(jìn)行革蘭氏染色，透射電鏡觀察以及莢膜粗多糖的提取。研究結(jié)果表明:Δcps2E對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速率明顯加快，穩(wěn)定期的菌量也明顯

8、增大;Δcps2E的形態(tài)多呈單個(gè)或兩兩排列，不同于野生菌株的鏈狀排列，并且Δcps2E的莢膜同野生菌株存在顯著差異;Δcps2E莢膜粗多糖的提取率僅為野生菌株的34.52％。
　　4.突變株Δcps2E生物學(xué)功能分析:
　　將突變株Δcps2E與野生菌株SC19于37℃，5％CO2條件下進(jìn)行細(xì)胞粘附侵入及吞噬試驗(yàn)。一方面，對(duì)人子宮頸癌細(xì)胞(Hela)的粘附侵入試驗(yàn)結(jié)果表明:Δcps2E的粘附能力差異不明顯，而侵入能力顯著增強(qiáng)

9、，是野生菌株的1.65倍;另一方面，小鼠肺泡巨噬細(xì)胞（RAW264.7）的吞噬試驗(yàn)結(jié)果表明:在4個(gè)互作時(shí)間段內(nèi)，RAW264.7對(duì)Δcps2E的吞噬率均極顯著高于野生菌株，故突變株Δcps2E的抗吞噬能力極顯著降低，更易被機(jī)體清除。
　　突變株Δcps2E與野生菌株SC19分別腹腔接種4周齡BALB/c小鼠，LD50的測(cè)定結(jié)果顯示突變株Δcps2E毒力下降4.47倍，cps2E基因?qū)?xì)菌的致病性存在影響。小鼠存活率試驗(yàn)中，突變株Δ