豬鏈球菌2型SLY與EF蛋白的原核表達及生物學特性鑒定.pdf

1、豬鏈球菌2型(Streptococcussuisserotype2，SS2)是世界范圍內(nèi)廣泛存在的一種重要的人畜共患性病原菌，可引起豬和人的關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、肺炎、敗血癥、中毒性休克綜合征甚至死亡。我國分別于1998年和2005年2次爆發(fā)SS2流行，造成大批豬群感染發(fā)病及數(shù)十人死亡，引起全球關(guān)注。SS2的致病機理、檢測和防治研究成為公共衛(wèi)生領域研究的熱點。
　　 本研究PCR擴增、克隆、原核表達了SS2的溶血素(suilysin，

2、SLY)和胞外蛋白因子(extracellularproteinfactor，EF)全長基因，獲得可溶性的rSLY蛋白與rEF蛋白，分析了rSLY蛋白的溶血活性，制備了rSLY、rEF的亞單位疫苗，建立了SS2SLY、EF蛋白抗體的ELISA檢測方法，最后研究了rSLY與rEF對豬流感病毒毒力的影響。
　　 1.鏈球菌2型SLY、EF的原核表達及生物學活性分析
　　 以SS2菌HA9801株的全基因組為模板，PCR擴增并

3、克隆豬溶血素(suilysin，SLY)和胞外蛋白因子(extracellularproteinfactor，EF)全長基因，與原核表達載體pET-28a連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中誘導表達，收集表達菌體，超聲破壁、鎳柱純化獲得可溶性的rSLY蛋白與rEF蛋白。建立的rSLY原核表達體系能高效表達可溶性的具有溶血活性的rSLY，建立的rEF原核表達系統(tǒng)能高效表達可溶性的rEF。鎳柱純化制備的rSLY、rEF純度達電泳純，分子量約為54ku、11

4、0ku。100mL重組菌菌體能純化出約8mg電泳純的rSLY與10mg電泳純的rEF。rSLY具有高溶血活性，溶血比活為4057HU/mg。rSLY對多種動物的紅細胞有溶血作用，對豬、兔和豚鼠的紅細胞溶血作用最強。rSLY在4℃保存溶血活性最穩(wěn)定，保存48h溶血活性不降低。在pH6-7和離子強度為500mmol/L時溶血活性最高。本研究獲得了高表達量、可溶性的、具有溶血活性的rSLY和大量可溶的rEF蛋白，首次系統(tǒng)研究了不同理化因素對r

5、SLY的生物學活性的影響，為SLY致病機理深入研究及SS2亞單位疫苗、診斷試劑的研制奠定了基礎。
　　 2.鏈球菌2型SLY與EF蛋白亞單位疫苗研制及其免疫效力評價
　　 分別制備rEF、rSLY、rEF+rSLY、SS2全菌液的油乳劑滅活疫苗，背部皮下多點注射免疫新西蘭兔，間隔10d免疫2次，每隔10d采血分離血清，建立ELISA方法檢測亞單位疫苗的抗體消長規(guī)律。結(jié)果表明，免疫亞單位疫苗以后，兔血清中產(chǎn)生了高滴度的相應

6、特異性抗體，且抗體水平均符合抗體的消長規(guī)律，即首免以后血液中的抗體水平逐漸升高，二免以后抗體又繼續(xù)增長，大約10d左右達到最高值，并維持約30d，之后就逐漸下降，最后維持一定的水平。而全菌滅活苗刺激機體產(chǎn)生了較低水平的SLY與EF抗體。
　　 3.豬鏈球菌2型SLY與EF蛋白增強豬流感病毒毒力的研究
　　 rSLY、rEF分別與豬流感病毒作用，接種MDCK細胞，觀察細胞病變和病毒增殖情況。豬流感病毒在rSLY蛋白的作用下