PPFIA1在慢性粒細(xì)胞白血病(CML)的功能及其相關(guān)磷酸化信號分子和相互作用蛋白的鑒定研究.pdf

1、研究背景：前期通過基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)相結(jié)合的方法研究發(fā)現(xiàn)miR-181a在慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）中有多個靶基因，經(jīng)實驗驗證PPFIA1受 miR-181a的直接調(diào)控，初步鑒定PPFIA1具有癌基因功能，但PPFIA1在CML中確切的分子作用機(jī)制尚不清楚。
　　研究目的：本課題致力于探索PPFIA1對CML惡性進(jìn)展的影響及其下游磷酸化信號分子和相互作用的蛋白鑒定，為白血病分子靶向治療提供新的實驗依據(jù)。
　　研究方法：

2、
　　1.利用PPFIA1慢病毒顆粒構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)PPFIA1蛋白的K562細(xì)胞；Western Blot驗證K562細(xì)胞內(nèi)PPFIA1表達(dá)水平；
　　2.脂質(zhì)體LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染PPFIA-siRNA到 K562細(xì)胞；
　　3.Biotool Vita-Blue試劑檢測PPFIA1對K562細(xì)胞藥物敏感性的影響；
　　4.甲基纖維素集落形成法檢測PPFIA1對K562細(xì)胞增殖能力的影響；

3、
　　5.Transwell小室法檢測PPFIA1對K562細(xì)胞侵襲能力的影響；
　　6.磷酸化抗體芯片檢測靶向抑制PPFIA1后K562細(xì)胞相應(yīng)磷酸化蛋白表達(dá)水平的改變，并在K562和KCL-22細(xì)胞中使用Western Blot驗證相關(guān)信號分子的改變；
　　7.利用flag-PPFIA1慢病毒顆粒構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)flag-PPFIA1融合蛋白的K562細(xì)胞株，flag-BCR/ABL和myc-PARP1質(zhì)粒構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)

4、flag-BCR/ABL的293T細(xì)胞株；
　　8.免疫沉淀（IP）flag-PPFIA1和flag-BCR/ABL融合蛋白，利用蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)鑒定兩組IP產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)組成。
　　9.Discovery Studio4.5 Client軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的空間模擬對接，分別預(yù)測與PPFIA1及BCR/ABL蛋白直接作用的特異性蛋白，對免疫沉淀產(chǎn)物中的特異性蛋白質(zhì)分子進(jìn)行Western blot實驗驗證。
　　10.P

5、ARP1抑制劑Olaparib處理K562-LentiV PPFIA1后CCK8檢測藥物敏感性及細(xì)胞克隆形成能力的變化。
　　研究結(jié)果：
　　1.Western Blot檢測病毒感染后K562-PPFIA1 LentiV比K562-empty LentiV細(xì)胞內(nèi)的PPFIA1蛋白表達(dá)水平明顯升高；
　　2.過表達(dá)PPFIA1基因后降低了K562細(xì)胞對Imatinib和Dasatinib的藥物敏感性，增強(qiáng)了K562細(xì)胞的

6、colony形成和侵襲能力；
　　3.靶向抑制PPFIA1增強(qiáng)了K562細(xì)胞對Imatinib的藥物敏感性，減弱了K562細(xì)胞的colony形成和侵襲能力；
　　4.磷酸化芯片顯示，靶向抑制PPFIA1蛋白磷酸化水平下降率高于20％的蛋白有28種。其中C-KIT(Tyr721)磷酸化水平下降最明顯，達(dá)76%，Western Blot結(jié)果顯示PPFIA1能激活C-KIT、Akt、ERK1/2磷酸化信號通路，靶向抑制PPFIA1

7、可以降低其磷酸化信號水平。
　　5.質(zhì)譜鑒定flag-BCR/ABL免疫沉淀產(chǎn)物有132種特異性蛋白，而flag-PPFIA1免疫沉淀產(chǎn)物有42種，其中PARP1和NCOA5是flag-PPFIA1和flag-BCR/ABL兩個免疫沉淀產(chǎn)物中共同存在的蛋白質(zhì)分子。
　　6.空間模擬對接和免疫共沉淀（Co-IP）結(jié)果顯示PPFIA1能和PARP1相互直接結(jié)合。
　　7.PARP1抑制劑Olaparib能顯著減弱K562-

8、LentiV PPFIA1細(xì)胞的活力和colony形成能力。
　　8.過表達(dá)PPFIA1可以激活PARP1/P65/C-KIT的磷酸化表達(dá)水平，靶向抑制PPFIA1和PARP1均可抑制P65和C-kit的磷酸化表達(dá)水平。
　　研究結(jié)論：
　　1.PPFIA1在CML中具有癌基因功能,靶向抑制PPFIA1基因的表達(dá)可以抑制CML惡性進(jìn)展。.
　　2.PPFIA1下游涉及C-KIT等28個磷酸化信號分子。