基于CD14-TLR-4-NF-κB通路探討清熱化濕類方藥干預(yù)胃癌研究.pdf

1、第一部分清熱化濕方含藥血清制備及其有效組份測(cè)定
　　目的:制備清熱化濕方中藥血清及測(cè)定其藥理學(xué)有效成分。
　　方法:選擇清潔級(jí)雄性SD大鼠30只，予清熱化濕類方藥灌胃，每日給藥2次，連續(xù)7天，于末次給藥后1h采血。腹主動(dòng)脈采血，血樣靜置于10ml離心管，離心，濾膜過(guò)濾除菌，置-20℃保存?zhèn)溆?。然后運(yùn)用高效液相色譜法測(cè)定清熱化濕方含藥血清成分。
　　結(jié)果:經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有峰保留時(shí)間RSD<1.27％；取上述溶

2、液分別于0、3、7、10、12h及20h進(jìn)樣，其共有峰保留時(shí)間RSD<0.2%，表明樣品溶液穩(wěn)定性。計(jì)算共有峰相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積同一后，形成對(duì)照?qǐng)D譜，在含藥血清的有形成分中以梔子苷和苦杏仁苷為主，而其他對(duì)照品都沒(méi)有峰或者無(wú)法確認(rèn)剩余成分。
　　結(jié)論:清熱化濕方含藥血清有效組分可能以梔子苷和苦杏仁苷為主，初步形成含藥血清質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
　　第二部分構(gòu)建穩(wěn)定沉默CD14胃癌SGC-7901細(xì)胞系
　　目的:通過(guò)CD1

3、4-shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染構(gòu)建穩(wěn)定沉默CD14胃癌SGC-7901細(xì)胞系。
　　方法:利用靶向性CD14shRNA慢病毒載體，轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細(xì)胞系。利用Real-timePCR和Westernblot分別檢測(cè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和CD14shRNA慢病毒載體組的CD14mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。
　　結(jié)果: CD14shRNA慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染至胃癌SGC-7901細(xì)胞系，RT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染CD14sh

4、RNA慢病毒組CD14的2-??Ct值（1±0.08）比NCshRNA對(duì)照組2-??Ct值(0.16±0.02)降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，CD14shRNA慢病毒組CD14蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.01，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于SGC-7901空白組（1.0）及陰性對(duì)照組（0.83）。
　　結(jié)論:通過(guò)CD14shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默CD14胃癌SGC-7901細(xì)胞系，從而抑制SGC-7901細(xì)胞系CD

5、14 mRNA及蛋白表達(dá)。
　　第三部分清熱化濕方對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞系生物學(xué)變化的干預(yù)研究
　　目的:觀察清熱化濕方含藥血清干預(yù)下胃癌SGC-7901細(xì)胞生物學(xué)變化，探討清熱化濕方防治胃癌的可能效用。
　　方法:以不含清熱化濕方含藥血清胃癌SGC-7901細(xì)胞為陰性對(duì)照(正常組)，以穩(wěn)定沉默CD14胃癌SGC-7901細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照（對(duì)照組），以應(yīng)用不同濃度（5%、10%、20%）清熱化濕方含藥血清干預(yù)人胃癌S

6、GC-7901細(xì)胞系作各治療組。應(yīng)用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期。觀察各組胃癌細(xì)胞凋亡、增殖抑制率、細(xì)胞周期等變化的差異。
　　結(jié)果:各組加藥前，細(xì)胞增殖比較，無(wú)顯著性差異，具有可比性；在加藥第1天，清熱化濕方治療組即對(duì)胃癌SGC-790細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制效應(yīng)，而對(duì)照組與正常組比較其細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療組在加藥第2天、第3天仍對(duì)SGC-790細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制效應(yīng)，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療組

7、S期比例（38.17%）明顯少于正常組（52.60%）及對(duì)照組（50.68%），正常組與對(duì)照組間比較無(wú)明顯差異。治療組細(xì)胞的早期、晚期及總凋亡率與對(duì)照組比較均明顯增高，而正常組與對(duì)照組間無(wú)明顯差異。各濃度治療組間胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖及抑制率、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:清熱化濕類方藥具有抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞合成、增殖，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的效用。
　　第四部分清熱化濕方對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞系C

8、D14，NF-κBp65,TNF-α,IL6,IL8,TLR-4的干預(yù)研究
　　目的:觀察清熱化濕方含藥血清干預(yù)下胃癌SGC-7901細(xì)胞系CD14/TLR-4-NF-κB通路中相關(guān)指標(biāo)變化，探討清熱化濕方對(duì)CD14/TLR-4-NF-κB通路的影響。
　　方法:以不含清熱化濕方含藥血清胃癌SGC-7901細(xì)胞為陰性對(duì)照(正常組)，以穩(wěn)定沉默CD14胃癌SGC-7901細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照（對(duì)照組），以應(yīng)用不同濃度（5%、10%、

9、20%）清熱化濕方含藥血清干預(yù)人胃癌SGC-7901細(xì)胞系作各治療組。應(yīng)用Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)CD14，IL6，IL8，NF-κBp65，TNF-α，TLR-4 mRNA表達(dá)情況，運(yùn)用Western Blot檢測(cè)CD14，NF-κBp65，TNF-α，IL6，IL8，TLR-4的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:與正常組比較，治療組CD14，NF-κBp65，TNF-α，IL6，IL8，TLR-4 mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯