氨來(lái)占諾抑制破骨細(xì)胞發(fā)生和卵巢切除后骨質(zhì)丟失及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　1.利用小鼠原代破骨前體細(xì)胞，研究氨來(lái)占諾對(duì)體外破骨細(xì)胞發(fā)生及功能的影響；
　　2.利用小鼠原代破骨前體細(xì)胞，進(jìn)一步研究氨來(lái)占諾對(duì)體外破骨細(xì)胞發(fā)生和功能影響的分子機(jī)制；
　　3.利用卵巢切除小鼠骨質(zhì)疏松模型，研究氨來(lái)占諾對(duì)體內(nèi)破骨細(xì)胞活性的影響，了解氨來(lái)占諾是否能抑制卵巢切除小鼠骨質(zhì)疏松模型的骨丟失。
　　方法：
　　1.取6-8周齡雌性C57BL/6小鼠，分離并培養(yǎng)小鼠原代破骨前體細(xì)胞（BMM

2、φ）；采用CCK-8方法檢測(cè)不同濃度的氨來(lái)占諾對(duì)BMMφ增殖的影響；采用抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)染色的方法檢測(cè)氨來(lái)占諾對(duì)BMMφ向破骨細(xì)胞分化的影響；采用FITC-Phalloidin和DAPI染色的方法檢測(cè)氨來(lái)占諾對(duì)BMMφ向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中肌動(dòng)蛋白環(huán)結(jié)構(gòu)形成的影響；利用Corning Osteo Assay Surface培養(yǎng)板檢測(cè)氨來(lái)占諾對(duì)BMMφ向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中骨吸收的影響；利用Boneslices牛皮質(zhì)骨片檢測(cè)氨來(lái)

3、占諾對(duì)BMMφ分化成熟破骨細(xì)胞骨吸收的影響。
　　2.取6-8周齡雌性C57BL/6小鼠，分離并培養(yǎng)小鼠原代破骨前體細(xì)胞；采用Western Bloting和化學(xué)發(fā)光法凝膠電泳遷移率的方法檢測(cè)氨來(lái)占諾對(duì)NF-κB激活的影響；采用Western Bloting方法檢測(cè)氨來(lái)占諾對(duì)MAPKs信號(hào)通路激活的影響；采用Western Bloting方法檢測(cè)氨來(lái)占諾對(duì)破骨細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中NFATcl/c-Fos蛋白表達(dá)的影響；采用實(shí)時(shí)定量RT-

4、PCR的方法檢測(cè)氨來(lái)占諾對(duì)破骨細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中破骨細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)的影響。
　　3.取12周齡雌性C57BL/6小鼠，建立卵巢切除小鼠骨質(zhì)疏松模型。用氨來(lái)占諾處理小鼠模型8周，取股骨做相應(yīng)檢測(cè)。采用μ-CT掃描的方法檢測(cè)氨來(lái)占諾對(duì)體內(nèi)微結(jié)構(gòu)變化的影響；采用組織形態(tài)學(xué)分析股骨TRAP染色切片，檢測(cè)氨來(lái)占諾對(duì)體內(nèi)破骨細(xì)胞活性的影響。
　　結(jié)果：
　　1.氨來(lái)占諾以一種劑量依賴性的方式抑制破骨細(xì)胞發(fā)生和破骨細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中的骨吸

5、收；氨來(lái)占諾在早期抑制BMMφ向破骨細(xì)胞的分化；氨來(lái)占諾在(0,1.5,3,6,12,25μM)濃度時(shí)，對(duì)BMMφ的增殖沒(méi)有明顯的抑制作用；氨來(lái)占諾抑制了BMMφ向破骨細(xì)胞分化過(guò)程中肌動(dòng)蛋白環(huán)結(jié)構(gòu)的形成；氨來(lái)占諾抑制了BMMφ分化成熟破骨細(xì)胞的骨吸收；
　　2.氨來(lái)占諾抑制RANKL誘導(dǎo)的NF-κB/p-65、ERK、JNK的磷酸化；抑制了破骨細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中c-Fos和 NFATc1蛋白的表達(dá)；減少了破骨細(xì)胞標(biāo)志基因，包括抗TRA