miRNAlet-7b修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是十分嚴(yán)重的脊柱疾病并發(fā)癥,常會(huì)引起損傷節(jié)段以下肢體嚴(yán)重的功能障礙，其發(fā)生率呈逐年上升的趨勢，但由于神經(jīng)元本身再生能力不足，脊髓損傷的治療一直是醫(yī)學(xué)界難點(diǎn)。隨著細(xì)胞技術(shù)的進(jìn)步，外源性干細(xì)胞移植為脊髓損傷的治療提供一種可能有效的方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有較強(qiáng)的自我更新和增殖能力，且來源廣泛、分離培養(yǎng)簡單，有望成為治療脊髓損傷的“種子細(xì)胞”。但由于移植后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在宿主體內(nèi)

2、成活率及轉(zhuǎn)化率較低，其在實(shí)驗(yàn)研究及進(jìn)一步應(yīng)用中受到很大的限制。miRNA是一類高度保守的非編碼小RNA分子，在生物體內(nèi)廣泛存在，對真核生物的基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控和個(gè)體發(fā)育等均有影響。有研究發(fā)現(xiàn)miRNAlet-7b有促進(jìn)干細(xì)胞分化，調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的自我修復(fù)和更新。但在治療脊髓損傷方面， miRNAlet-7b修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是否比單純的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)療效更好，目前尚未有研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖峭ㄟ^免疫組織化學(xué)染色法檢測骨

3、髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后大鼠脊髓組織中神經(jīng)絲蛋白200（neuro filament200，NF-200）和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（gilal fibrillary acidic protein, GFAP）的表達(dá)，初步探討miRNAlet-7b修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠脊髓損傷修復(fù)中的作用及其機(jī)制。
　　方法：選取SD大鼠60只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：對照組、BMSCs組、miRNA組，每組20只。3組均采用改良Allen’s法制備T

4、12脊髓損傷模型。造模后1周，對照組僅在損傷部位注射等量的生理鹽水，BMSCs組大鼠移植陰性對照慢病毒載體感染的 BMSCs，miRNA組大鼠移植 miRNA let-7b慢病毒載體感染的BMSCs。分別于移植后3天、1周、2周、4周、8周按Basso Beattie Bresnahan（BBB）標(biāo)準(zhǔn)量表對大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評分。采用免疫組織化學(xué)染色法檢測并統(tǒng)計(jì)脊髓組織中NF200染色陽性細(xì)胞數(shù)和GFAP染色陽性面積，應(yīng)用HE染色方法

5、評估損傷段脊髓組織的病理變化。所有數(shù)據(jù)均用SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，定量資料用x±s的形式來表示。各組間比較采用單因素方差（ANOVA）分析，如3組方差齊時(shí)，采用t（LSD-t）檢驗(yàn)進(jìn)行組間的比較，如3組之間方差不齊時(shí)，則采用Tamhane’s T2進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1、造模后3組大鼠均出現(xiàn)了嚴(yán)重的雙下肢功能障礙，此時(shí)3組大鼠BBB評分結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.500，P=0.6

6、22）；細(xì)胞移植后，3組大鼠 BBB評分均不斷升高，大鼠雙下肢運(yùn)動(dòng)功能也有所改善，移植后各時(shí)間點(diǎn)大鼠BBB評分比較：miRNA最高、BMSCs組次之、對照組最低，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2、NF200免疫組化結(jié)果顯示：細(xì)胞移植后3天，3組大鼠脊髓內(nèi)NF200陽性細(xì)胞數(shù)比較，miRNA組略高，但各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.275，P=0.325）；隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，細(xì)胞移植后1周、2周、4周、8周NF200染色

7、陽性細(xì)胞數(shù)均不斷增多，其中miRNA組最多、BMSCs組次之、對照組最少，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）
　　3、GFAP免疫組化結(jié)果顯示：對照組GFAP染色陽性面積比較持續(xù)性升高，miRNA組和BMSCs組先升高后降低。3組GFAP染色面積比較：對照組最高、BMSCs組次之，miRNA組最低，3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4、HE染色觀察：3組大鼠脊髓組織內(nèi)均可見組織結(jié)構(gòu)紊亂充血，神經(jīng)細(xì)胞水腫等病

8、理變化，miRNA組和BMSCs組病理學(xué)改變較對照組輕。
　　結(jié)論：
　　1、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可以提高脊髓損傷大鼠的雙下肢功能， miRNAlet-7b修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠脊髓損傷修復(fù)效果更好。
　　2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在脊髓組織微環(huán)境下能分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞， miRNAlet-7b能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可以減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP表達(dá)量，抑制損傷脊髓組織中膠質(zhì)瘢