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文檔簡介
1、新的致癌基因CSF3R突變對慢性中性粒細胞白血病影響的研究
本文主要研究一個新發(fā)現(xiàn)的基因—粒細胞集落刺激因子受體(CSF3R),它的突變尤其是突變位點CSF3R-T618I,以及我們首次報道的突變位點CSF3R-H54A對慢性中性粒細胞白血病的分子發(fā)病機理的影響。
第一部分.病例報告
慢性中性粒細胞白血病伴EVI-1基因高表達和CSF3R、SETBP1基因突變
背景:慢性中性粒細胞白血?。–NL)
2、是一種罕見的骨髓增殖性腫瘤(MPN),表現(xiàn)為持續(xù)的中性粒細胞增多,脾腫大,骨髓粒系增生而不伴有明顯的發(fā)育異常,費城(Ph)染色體陰性。我們的病例特點是伴有顯著和持續(xù)的中性粒細胞增多,NAP積分值增高,Ph染色體及BCR-ABL融合基因陰性,并排除導(dǎo)致類白血病反應(yīng)的潛在疾病。在我們的病例中,初次接診病人并無肝脾腫大,但其他的實驗室檢查結(jié)果滿足WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)。一年后患者由于疾病進展,出現(xiàn)牙齦出血,脾腫大,淋巴結(jié)腫大。該患者在臨床治療過程中外
3、周血細胞計數(shù)的平均值如下:白細胞28.36×109/L(范圍7.67-51.28 X109/L),成熟中性粒細胞占88.5%(范圍78.8-98.5%),血小板33.3×109/L(范圍23-94×109/ L)。在治療的過程中,患者出現(xiàn)了血小板減少癥,并逐漸對羥基脲和IFN-α治療反應(yīng)不佳。材料/方法:收集該CNL患者的外周血,利用Ficoll梯度密度分離方法獲取外周血單個核細胞(PMNCs),并將其置于完全培養(yǎng)基,37℃,5%CO2
4、的溫箱中培養(yǎng)。利用LSR II流式細胞儀檢測中性粒細胞的功能,如細胞凋亡,細胞周期和細胞遷移能力。將中性粒細胞置于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),在不同時間點,收集細胞并用Annexin V和PI(BD Pharmingen公司)標(biāo)記,檢測細胞凋亡與正常對照組的差異。將純化的中性粒細胞培養(yǎng)在transwell小室(1×106/孔),并且將趨化肽N-甲?;琢虬滨A涟滨1奖滨#╢MLP,1uM,SIGMA)加入到下室中。在
5、每個時間點,我們計數(shù)下室的中性粒細胞數(shù)量,檢測中性粒細胞的遷移能力。通過FACSAria III(BD Biosciences公司)流式細胞儀分別分選CD34+和CD15+的細胞,利用基于PCR的DNA焦磷酸測序方法檢測致癌基因CSF3R整個外顯子和內(nèi)含子的突變情況。
結(jié)果:該病人的成熟中性粒細胞占93.9%。利用流式細胞儀檢測細胞凋亡的結(jié)果顯示,該患者的中性粒細胞96h后仍然存活,而正常對照組中的中性粒細胞在72h后僅少量存
6、活。細胞周期結(jié)果顯示正常,提示所有的細胞都發(fā)生終末分化,而沒有細胞分裂。實驗組中性粒細胞對由fMLP誘導(dǎo)的的遷移活性明顯低于正常對照細胞,但比正常陰性對照更高(不含fMLP)。有趣的是,我們通過定性檢測方法觀察到EVI-1基因陽性。我們還分選了CD34+、CD15+的細胞以及骨髓細胞,3次通過熒光定量RT-PCR方法檢測EVI-1基因的表達水平。我們發(fā)現(xiàn),這些定量結(jié)果相似,尤其是骨髓細胞和CD34+細胞EVI-1基因均高表達,而CD15
7、+的細胞EVI-1基因陽性,但其表達水平較低。
該病人CD34+和CD15+的細胞的CSF3R膜近端第14個外顯子存在T618I突變。此外,我們還發(fā)現(xiàn)CSF3R第4外顯子存在H54A的雜合突變。我們還擴增了體細胞SETBP1基因,并對其第3個外顯子706-917之間的密碼子進行測序,評估SETBP1基因突變情況。我們的結(jié)果顯示該患者體細胞SETBP1基因存在雜合突變(2602C>A),導(dǎo)致868位的天冬氨酸突變?yōu)樘於0贰?b
8、r> 結(jié)論:該患者為67歲的老年男性,表現(xiàn)為持續(xù)的中性粒細胞增多和血小板減少,不存在BCR-ABL1融合基因和JAK2基因V617F突變,伴EVI-1基因過度表達和CSF3R和SETBP1并發(fā)突變。我們首次發(fā)現(xiàn)CSF3R-H54A突變位點,并最終診斷為CNL。我們接下來的研究將進一步闡釋突變位點對CNL的分子發(fā)病機理的影響。
第二部分
CSF3R基因突變位點對CNL克隆優(yōu)勢的作用研究
目的:檢測CSF3R
9、-FL、CSF3R-T618I和CSF3R-H54A突變對CNL的分子發(fā)病機制的影響
材料/方法:
1.質(zhì)粒構(gòu)建:使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)方法擴增插入物,限制性酶切和連接構(gòu)建質(zhì)粒。過程概括如下:宿主載體pLV-EF1α-EYFP-N,pLP-2,pVSV-G,pLP-1利用試劑盒(Omegabio-tek maxi prep kit)純化,并通過限制性內(nèi)切酶(ECORI,NOTI)酶切。利用DNA提取試劑盒(AxyPre
10、p TM DNAGel Extraction Kit)對瓊脂糖凝膠中的線性化的載體進行純化,樣品濃度的估測參照溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠上的DNA Maker。所有插入物(CSF3R-FL,CSF3R-T618I,CSF3R-H54A)通過PCR擴增獲得。擴增的DNA片段使用DNA提取試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收純化,并通過ECO RI,NOTI酶切使載體線性化。酶切反應(yīng)如下:i)插入體系(反應(yīng)總體積40μl):100-3000ng純化的PC
11、R產(chǎn)物,適量的消化酶,10×反應(yīng)緩沖液4μl,置于適當(dāng)?shù)臏囟冗^夜反應(yīng);ⅱ)載體體系(反應(yīng)總體積20μl):2000-4000ng質(zhì)粒DNA,適量的消化酶,10×反應(yīng)緩沖液2μl,適當(dāng)?shù)臏囟认路磻?yīng)4小時。必要時將酶切的片段再次純化,插入物的濃度評估方法同上。將載體:插入物按1:3的摩爾比加入體系用于連接反應(yīng)。將連接反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到化學(xué)感受態(tài)細胞DH5α大腸桿菌,并置于含氨芐青霉素(Sigma公司)的LB瓊脂平板上生長。一天后挑取單菌落,接
12、種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。質(zhì)粒從上述過夜培養(yǎng)物中純化,并通過限制性圖譜測試插入體的存在與否。所選克隆用Sanger方法測序。
2.慢病毒包裝:我們的系統(tǒng)包括了3種主要成分,如慢病毒表達載體(CSF3R-FL和CSF3R-T618I質(zhì)粒DNA),慢病毒包裝質(zhì)粒(pLP-1,pLP-2,pVSV-G),293TN細胞。我們將1×105個293TN細胞接種到10cm2培養(yǎng)皿中,加入2-3ml含4mM L-谷氨酰胺、
13、4.5 g/l葡萄糖和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2的溫箱中培養(yǎng)18-24h。當(dāng)細胞匯合率達到60%~80%時用于轉(zhuǎn)染。我們利用綠色熒光蛋白(GFP)作為陽性對照,來證實轉(zhuǎn)染成功與否。再收集含感染性假病毒顆粒的培養(yǎng)基上清液。
3.將假病毒顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)到小鼠骨髓原始細胞:我們利用 MethoCultTM培養(yǎng)基進行小鼠骨髓細胞集落培養(yǎng),用于評估CNL相關(guān)的致癌基因?qū)π∈蠊撬柙技毎男螒B(tài)和數(shù)量的影響。其中,我們
14、設(shè)立了不含病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和不表達目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的對照組(CSF3R-FL,CSF3R-T618I)。
結(jié)果:
1、我們成功提取和純化了含CSF3R-FL和CSF3R-T618I重組質(zhì)粒的克隆,但未獲得CSF3R-H54A重組質(zhì)粒的克隆。
2、轉(zhuǎn)染293TN細胞24h后,在熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白。
3、CSF3R兩種克隆均能轉(zhuǎn)導(dǎo)到小鼠集落形成細胞,于接種7天后顯微鏡下計數(shù)CFU-GM克隆,其中膜近端突
15、變T618I轉(zhuǎn)導(dǎo)的粒單-集落形成單位(CFU-GM)計數(shù)多于全長非突變株(CSF3R-FL),提示CSF3R-T618I突變有利于CNL白血病細胞的克隆。
結(jié)論:
1、質(zhì)粒構(gòu)建、病毒包裝和小鼠骨髓細胞集落形成實驗均順利完成。
2、我們證實了CSF3R突變的轉(zhuǎn)導(dǎo)能力,并發(fā)現(xiàn)CSF3R-T618I轉(zhuǎn)導(dǎo)能力強于CSF3R-FL。該結(jié)果表明CSF3R-T618I突變有利于CNL白血病細胞的克隆。
3、我們
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