適體篩選方法及分離方法的探討.pdf

1、核酸適體(aptamer)是指從人工構(gòu)建的隨機(jī)單鏈序列中篩選出的能與蛋白質(zhì)、其他小分子物質(zhì)、有機(jī)離子等等各種配體特異結(jié)合的寡核苷酸片段。它是經(jīng)體外指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)篩選出來(lái)的一系列單鏈寡核苷酸分子，一般由20～80個(gè)堿基組成，對(duì)可結(jié)合的配體有嚴(yán)格的識(shí)別能力和高度的親和力。
　　 目前篩選核酸適體

2、的SELEX技術(shù)是分子進(jìn)化工程技術(shù)的一種。核酸分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)上存在著大量不同順序的寡核苷酸的排列組合。我們可以利用人工化學(xué)合成技術(shù)把設(shè)計(jì)好的一定長(zhǎng)度的不同排列組合的寡核苷酸都合成出來(lái)，構(gòu)建成一個(gè)包含了這一長(zhǎng)度寡核苷酸分子所有可能的突變的寡核苷酸文庫(kù)，這樣就可以在實(shí)驗(yàn)條件中模擬大自然的進(jìn)化，有目的地施加選擇壓力，篩選出符合特定要求的寡核苷酸分子。
　　 采用SELEX方法篩選適體的關(guān)鍵問(wèn)題是將與靶標(biāo)結(jié)合的ssDNA與未結(jié)合的游離s

3、sDNA分離。本研究的主要探討適體篩選過(guò)程中的篩選方法和分離問(wèn)題。全文分為3部分分別探討了3種篩選適體的方法和相關(guān)的分離方法：
　　 一、膠體金為分離介質(zhì)的SELEX技術(shù)篩選適體：以豬瘟病毒單克隆抗體和促絨毛膜性腺激素(HCG)單克隆抗體為靶標(biāo)進(jìn)行適體的篩選，通過(guò)12輪篩選，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳發(fā)現(xiàn)目的寡核苷酸條帶丟失。用超濾離心管作為分離介質(zhì)，繼續(xù)對(duì)HCG單克隆抗體進(jìn)行適體篩選，經(jīng)PAGE膠電泳發(fā)現(xiàn)在第五輪篩選中的

4、第10次洗液中仍然有核酸條帶。
　　 二、硝酸纖維膜(NC)為分離介質(zhì)的雙鏈DNA文庫(kù)法：以固定在NC膜上的HCG單克隆抗體為靶標(biāo)，以隨機(jī)雙鏈DNA文庫(kù)為出發(fā)庫(kù)進(jìn)行核酸適體篩選，經(jīng)1輪篩選，PAGE電泳有目的寡核苷酸條帶，但在對(duì)照用的空膜中也出現(xiàn)相同的寡核苷酸條帶。
　　 三、變性-復(fù)性法：以硝酸纖維膜(NC)和PDFV膜為分離介質(zhì)，以蛋白酶K為靶標(biāo)，以硫醇探針作為跟蹤檢測(cè)，通過(guò)1輪篩選，在PAGE膠電泳中有目的核酸條帶