具有不同數(shù)量幾丁質結合域的雜交幾丁質酶的構建及特性分析.pdf

1、昆蟲病原真菌是自然界控制昆蟲種群數(shù)量的重要因素之一，具有直接穿透昆蟲體壁而使其致病的獨特機制。在穿透昆蟲體壁的過程中，真菌會分泌一系列的水解酶，如幾丁質酶和蛋白酶，降解寄主體壁，幫助菌絲穿透。結構分析表明，大多數(shù)幾丁質酶具有多個結構域，包括催化域、鉸鏈區(qū)和幾丁質結合域。幾丁質結合域能幫助幾丁質酶結合到幾丁質底物上，提高局部區(qū)域的酶濃度，從而促進對底物的降解。然而目前發(fā)現(xiàn)的來自昆蟲病原真菌的幾丁質酶缺乏幾丁質結合域。本實驗室的前期工作表明

2、，在不具有幾丁質結合域的昆蟲病原真菌幾丁質酶Bbchitl上添加家蠶幾丁質酶的幾丁質結合域，可以提高幾丁質酶Bbchitl對不溶性底物的結合及降解能力。在球孢白僵菌中超量表達該融合蛋白，菌株的毒力得到顯著提高。但是添加更多的幾丁質結合域是否可以進一步增強幾丁質酶與底物的結合能力，促進對底物的降解，從而進一步提高菌株的毒力呢?基于此設想，本文在前期工作的基礎上構建了具有多個幾丁質結合域的雜交幾丁質酶，并進行了表達及特性分析。 獲得

3、的主要結果如下： 1．雜交幾丁質酶畢赤酵母表達載體的構建在具有一個幾丁質結合域的雜交幾丁質酶Bbchitl-BmChBD(本實驗室構建)基礎上，構建了具有兩個和三個幾丁質結合域的雜交幾丁質酶的酵母表達載體pPIC9K-Bbchitl-(BmChBD)<,2>和pPIC9K-Bbchitl-(BmChBD)<,3>。 2．雜交幾丁質酶的酵母表達及特性分析在畢赤酵母中表達并純化了帶有1、2和3個幾丁質結合域的雜交幾丁質酶Bb

4、chitl-BmChBD、Bbchitl-(BmChBD)<,2>、Bbchitl-(BmChBD)<,3>和野生型幾丁質酶Bbchitl。結合分析和酶學特性分析結果表明：1)在酶濃度為80μg/mL時，幾丁質結合域的個數(shù)和雜交幾丁質酶與粉末幾丁質的結合存在劑量效應，即隨著幾丁質結合域數(shù)量的增加，雜交幾丁質酶與粉末幾丁質的結合能力增強。雜交幾丁質酶Bbchitl-BmChBD、Bbchitl-(BmChBD)<,2>和Bbchitl-(

5、BmChBD)<,3>與粉末幾丁質的結合率分別為 64.4％、67.4％和86.8％，明顯高于野生型幾丁質酶(4.3％)。而酶濃度為40μg/mL 時，雜交幾丁質酶與粉末幾丁質的結合無明顯差異。2)添加幾丁質結合域對幾丁質酶的最適反應溫度和最適反應pH無明顯影響，野生型和雜交幾丁質酶均在pH5.0和55℃的條件下具有最高的幾丁質酶活性。雖然添加幾丁質結合域提高了幾丁質酶降解不溶性底物的能力，卻降低了雜交酶的熱穩(wěn)定性。 3．雜交幾丁質酶球

6、孢白僵菌表達載體的構建為了進一步分析幾丁質結合域對球孢白僵菌毒力的影響，構建了Bbchitl-(BmChBD)<,2>和Bbchitl-(BmChBD)<,3>的球孢白僵菌表達載體 puc-bar∶∶gfp-Bbchitl-(BmChBD)<,2>和puc-bar∶∶gfp-Bbchitl-(BmChBD)<,3>。在下一步工作中，將進行相應的生測試驗。 本論文研究表明添加2個和3個幾丁質結合域BmChBD可以增加雜交幾丁質酶對