石油降解性質(zhì)粒的提取及c23O基因的克隆與表達.pdf

1、迅速發(fā)展的石油工業(yè)帶給我們的不僅是巨大的經(jīng)濟效益,還包括日益嚴重的環(huán)境污染問題。用于強化降解的微生物菌種通常是自然界篩選的混合菌群,組成比例在使用過程中容易發(fā)生變化,并可能在實際應用中發(fā)生競爭、抑制的情況。所以,利用遺傳工程技術(shù)獲得可用于提高整個降解效率的多功能基因工程菌意義重大。本研究以本實驗室分離并保存的8株石油降解菌LY-1、LY-2、LY-3、LY-4、LY-5、LY-6、LY-7、LY-8為研究對象,進行質(zhì)粒提取,獲得了對石油

2、降解非常重要的降解性質(zhì)粒(degradative plasmid),并成功的克隆出了鄰苯二酚2,3-雙加氧酶基因(c23O),并對此基因進行了表達和功能研究。在質(zhì)粒檢測實驗中,得到的質(zhì)粒帶大于20 kb,對于大質(zhì)粒提取研究較少,所以運用幾種質(zhì)粒提取方法進行質(zhì)粒的抽提,從菌株LY-5中,提取出較為清晰的大質(zhì)粒。在經(jīng)鄰苯二酚誘導后LY-5菌株中檢測到了鄰苯二酚2,3雙加氧酶(CatO2ase)酶活,這表明LY-5菌株的細胞內(nèi)含有鄰苯二酚降解

3、路徑。對質(zhì)粒進行初步降解功能研究發(fā)現(xiàn),該質(zhì)粒具有石油降解特性。查閱相關(guān)文獻,查找質(zhì)粒上可能存在的降解性基因。確定要克隆的目的基因是c23O基因,在Genbank上查找此基因的同源序列,并設(shè)計引物,以菌株LY-5中提取的質(zhì)粒為模板,通過PCR的方法進行基因克隆,得到了c23O基因并進行測序,對測序結(jié)果進行生物信息學分析。c23O基因序列全長924 bp,編碼307 aa,蛋白的分子量為34.86 kDa,理論等電點為5.35。編碼區(qū)G+C

4、含量為54.87 %,A+T含量為45.13 %,為典型的原核生物的堿基含量特征。c23O基因的氨基酸序列保守區(qū)預測表明與其匹配的保守區(qū)共有3個,pfam00903；COG0346；COG2514。Pfam蛋白家族預測表明,該基因同屬于PF00903家族,分值：81.8,E-value：2.1e-21。從BlastP相似性搜索結(jié)果表明基因與惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的基因相似性達到99%。菌株LY-5的c23O

5、基因與已知產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)的c23O基因編碼基因編碼的多肽氨基酸序列相似性不高,與來源于假單胞菌屬的熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)和惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)的酶基因序列的相似性較高。將克隆得到的c23O基因構(gòu)建原核表達載體pGEX-c23O,通過PCR、重組質(zhì)粒提取和雙酶切檢測證明重組載體構(gòu)建成功。通過IPTG誘導使c23O基因在大腸桿菌(Escherichi

6、a coli)中表達,SDS-PAGE檢測獲得64 kDa左右的融合蛋白帶,大小與預期相符,說明它們已經(jīng)在大腸桿菌中表達。IPTG誘導3小時,胞內(nèi)酶活性達到最高476.7 mu/ml。對胞外、胞內(nèi)、胞間質(zhì)總酶活進行計算,得到最高酶活活性545 mu/ml。成功表達出鄰苯二酚2,3-雙加氧酶酶活,且顯示其表達蛋白在表達宿主菌中主要以胞內(nèi)酶的形式存在。同時,也證明了產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)的c23O基因能夠在原核生物中良好表達。