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文檔簡介
1、目的:
糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy, DN)是糖尿病的主要并發(fā)癥,也是導致終末期腎病的主要原因。DN病理早期表現(xiàn)為足細胞凋亡、數(shù)量減少,引發(fā)濾過膜功能障礙,最終造成大量蛋白尿和腎功能衰竭。因此,抑制足細胞凋亡,減少蛋白尿是DN預防和治療中的關鍵問題。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)干細胞對DN有良好的治療作用,這種作用可能與干細胞的旁分泌機制有關。其中,外泌體(Exosomes)是干細胞旁分泌機制中發(fā)揮作用的有效成分。但
2、是用干細胞來源的Exosomes治療DN的研究罕有報道。
本課題通過建立1型DN大鼠模型,研究USCs來源的Exosomes(USCs-Exo)對DN腎臟損傷的保護作用,探討其可能的機制。
方法:
①USCs及其分泌USCs-Exo的分離、培養(yǎng)、鑒定:采用特定培養(yǎng)基從人的尿液中分離USCs,通過流式細胞術鑒定其表面標記分子,并對其多向分化潛能進行鑒定。采用超高速離心法從USCs培養(yǎng)上清中提取USCs-Exo
3、,透射電鏡分析其形態(tài)、大小,蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blotting)法檢測特異性蛋白CD9、CD63和CD81的表達。
?、?型糖尿病大鼠模型的建立、分組:采用鏈脲佐菌素腹腔注射構(gòu)建1型糖尿病大鼠模型,實驗分為:正常對照組(Normal),糖尿病組(Diabetes)和糖尿病USCs-Exo治療組(Diabetes+USCs-Exo)。
?、踀SCs-Exo對1型糖尿病大鼠腎臟的保護作用:每周檢測各組大鼠的隨
4、機血糖,每4周檢測血清肌酐、尿素氮,收集24小時尿液檢測尿肌酐、尿白蛋白水平,計算尿微量白蛋白/肌酐(urinary microalbumin-to-creatinine ratio,UACR)。12周后處死大鼠,PAS染色進行腎組織病理學檢查,普通光學顯微鏡觀察腎小球系膜基質(zhì)增生變化,并計算腎小球系膜面積(Mesangial area)TUNEL法染色觀察腎小球細胞凋亡情況;Real time PCR法和Western blottin
5、g法檢測)腎臟組織的凋亡相關Bcl-2、Bax和Caspase-3基因和蛋白的表達水平。
?、躑SCs-Exo對體外高糖刺激的人足細胞(Human Podocyte, HPDC)的保護作用:USCs-Exo干預高糖培養(yǎng)HPDC分為——正常葡萄糖對照組(NG組)、甘露醇高滲對照組(MA組)、高糖組(HG組)、 HG+ USCs-Exo(5ug/ml,10ug/ml和50ug/ml)干預組;72小時后,采用Annexin V-FIT
6、C/PI雙染后流式細胞術檢測細胞的凋亡率,Western blotting法檢測HPDC凋亡蛋白Caspase-3的表達, Real time PCR檢測足細胞特異性分子Synaptopodin的基因相對表達量。
結(jié)果:
?、購男迈r尿液中成功分離出USCs和USCs-Exo,為進一步的實驗設計提供了充足可靠的原料:USCs培養(yǎng)5-7天后開始貼壁生長,12-16天類似成纖維細胞樣的細胞呈集落生長,傳代2-3次后細胞逐漸被
7、拉長,保持均一的成纖維細胞樣生長。USCs表達間充質(zhì)干細胞相似的表面分子CD29、CD90、CD73、CD44,不表達CD34和HLA-DR,表明USCs符合間充質(zhì)干細胞的特征,同時USCs在體外經(jīng)成骨、成脂培養(yǎng)基的誘導培養(yǎng)后,USCs成功分化為成骨、成脂細胞。從P3代USCs的條件培養(yǎng)基中提取出USCs-Exo,經(jīng)透射電鏡檢查USCs-Exo大小在30-120nm,囊泡樣,表達進化上相對保守的蛋白CD9、CD63和CD81。
8、 ②USCs-Exo能改善糖尿病大鼠UACR,減少腎小球系膜增生,減少組織細胞的凋亡,改善腎臟功能,延緩DN的發(fā)生、發(fā)展:同Normal組相比,Diabetes組的大鼠尿量和UACR顯著性升高(P<0.05),4周即達到DN標準;Diabetes+USCs-Exo組4周、8周、12周UACR(19.2±2.3 mg/g,26.4±2.9 mg/g,23.4±3.2 mg/g)較同時間點Diabetes組UACR(43±4.5 mg/g,
9、55±6.0 mg/g,74.7±5.8 mg/g)明顯減少,并且沒有達到DN的微量白蛋白尿標準;同Normal組相比,Diabetes組腎臟病理檢查示腎小球體積增大、系膜區(qū)增寬、系膜基質(zhì)明顯增多;腎小球內(nèi)存在明顯的細胞凋亡,Bcl-2的基因和蛋白表達顯著降低,Bax和Caspase-3顯著升高。而Diabetes+USCs-Exo治療組的腎臟病理和凋亡相關Bcl-2、Bax、Caspase-3的改變均得到顯著性改善(P<0.05)
10、r> ③USCs-Exo能減少體外高糖導致的HPDC凋亡和損傷:同NG組相比,HG組在培養(yǎng)72小時后,HPDC synaptopodin表達下降,在72h的凋亡率明顯升高(P<0.05),Caspase-3表達增多(P<0.05)。與HG組相比,USCs-Exo治療組抑制synaptopodin的表達下調(diào),以USCs-Exo濃度依賴性的減少HPDC凋亡率(P<0.05),并下調(diào)Caspase-3蛋白的表達(P<0.05)。
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