氫氣通過(guò)抑制ASK1-JNK通路減輕大鼠慢性氧中毒的研究.pdf

1、氧氣是臨床治療各種疾病常用的輔助手段，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是高壓氧治療，高壓氧治療通過(guò)提高氧氣在血漿中溶解量，增加血氧分壓，改善組織氧供。但是長(zhǎng)時(shí)間吸入高濃度氧（氧分壓超過(guò)50％）會(huì)導(dǎo)致慢性氧中毒(COT)，研究表明，其發(fā)生機(jī)制主要是：高濃度氧進(jìn)入機(jī)體后，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），過(guò)量的活性氧會(huì)導(dǎo)致肺部發(fā)生廣泛的炎性反應(yīng)以及氧化應(yīng)激損傷，從而使毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生壞死、凋亡，最終引起肺組織結(jié)構(gòu)病變及肺功能障礙。有研

2、究表明，絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號(hào)途徑在慢性氧中毒所引起的肺損傷中具有重要功能，細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)是細(xì)胞絲裂原活化蛋白激酶激酶(MAPKKK)家族成員之一，是連接ROS和MAPKs通路的關(guān)鍵分子，在慢性氧中毒中被激活，通過(guò)MKK3/6和MKK7激活下游P38和JNK蛋白激酶從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致多種應(yīng)激損傷和促炎因子的釋放，參與病理生理過(guò)程，有報(bào)道稱，除ROS外，胞內(nèi)鈣離子濃度升高、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、腫瘤壞死因子均可誘

3、導(dǎo)ASK1的表達(dá)。最近的研究表明，ASK1抑制劑對(duì)氧中毒肺損傷具有保護(hù)作用，ASK1敲除后，細(xì)胞IL-1β、IL-6以及TNF-α釋放量降低，炎癥反應(yīng)減弱。
　　在臨床上治療中，若患者發(fā)生慢性氧中毒則會(huì)出現(xiàn)非常令人尷尬的局面：如果不提高呼吸氣體的氧濃度會(huì)引發(fā)缺氧，然而氧氣本身會(huì)對(duì)肺產(chǎn)生損傷效應(yīng)，若提高呼吸氣體的氧濃度則會(huì)導(dǎo)致肺功能進(jìn)一步惡化，因此一旦患者遇到這種緊張矛盾的局面，臨床醫(yī)生往往無(wú)計(jì)可施。研究發(fā)現(xiàn)，在救治急性呼吸衰竭病人

4、以及早產(chǎn)兒時(shí)，常需長(zhǎng)期吸氧，結(jié)果導(dǎo)致氧中毒肺功能損傷，部分嬰兒會(huì)發(fā)生支氣管肺發(fā)育不良、肺間質(zhì)纖維化、肺部炎癥等病理現(xiàn)象，重者甚至?xí)l(fā)嚴(yán)重的肺功能障礙，因此臨床用氧受到了一定程度的限制。此外在潛水作業(yè)領(lǐng)域，為了避免發(fā)生氧中毒的現(xiàn)象，必須嚴(yán)格限定吸入氣體中的氧分壓以及持續(xù)吸氧時(shí)間，同時(shí)也嚴(yán)重影響了作業(yè)效率。因此，深入探討研究慢性氧中毒的防治措施及其保護(hù)機(jī)制對(duì)臨床和軍事具有重要意義。
　　關(guān)于慢性氧中毒主要以預(yù)防為主，患者若需常期高壓

5、氧治療，則需要使用自由基清除劑輔助治療，且在治療過(guò)程中需要采用間斷式的吸氧方式，防止氧中毒的發(fā)生，但是到目前為止在氧中毒的治療上仍沒有有效手段。
　　近年來(lái)對(duì)氫氣的作用機(jī)制研究進(jìn)展迅速，氫氣有望成為一種新型的氣體信號(hào)分子發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。2007年有學(xué)者首次報(bào)道，吸入2%的氫氣可有效地減輕大腦缺血再灌注損傷。在肺部疾病治療方面，有報(bào)道證實(shí)氫氣可顯著減輕燒傷后肺損傷，同時(shí)對(duì)機(jī)械通氣所造成的肺損傷以及肺的缺血再灌注損傷具有顯著的治

6、療效果。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：氫氣飽和生理鹽水可以通過(guò)降低高分壓氧暴露導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)而減輕慢性氧中毒肺功能損傷，本研究基于前期工作進(jìn)一步從凋亡及其信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)方面探討氫氣發(fā)揮氧中毒保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制。
　　本研究首先明確氫氣對(duì)慢性氧中毒的保護(hù)作用。首先，建立大鼠慢性氧中毒模型（吸入98%純氧，氧艙持續(xù)暴露60小時(shí)，每12小時(shí)進(jìn)行腹腔注射生理鹽水、氫氣飽和生理鹽水（10ml/kg）進(jìn)行治療，共4次，時(shí)間點(diǎn)分別為動(dòng)物進(jìn)艙后12、24

7、、36、48小時(shí)，暴露共60小時(shí)后，動(dòng)物出艙），以吸入常氧空氣組為對(duì)照，效應(yīng)學(xué)指標(biāo)采用肺臟濕干比和胸膜腔滲出液含量測(cè)定，血?dú)夥治鰴z測(cè)動(dòng)脈血氧飽和度，肺組織切片HE染色觀察肺臟病理改變，TUNEL染色觀察肺組織細(xì)胞凋亡。我們?cè)诔晒⒙匝踔卸灸Ｐ偷幕A(chǔ)上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：發(fā)現(xiàn)氫氣治療可以顯著減輕大鼠氧中毒后肺水腫程度及炎性滲出，并且氫氣治療可以有效緩解氧中毒引起的血氧水平下降。氫氣治療組顯著改善氧中毒引起的肺臟形態(tài)學(xué)破壞，抑制細(xì)胞凋亡。該部分

8、結(jié)果提示，氫氣飽和生理鹽水對(duì)慢性氧中毒具有保護(hù)作用。
　　其次，對(duì)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行研究，以ASK1為入手點(diǎn)，對(duì)氫氣保護(hù)慢性氧中毒的機(jī)制進(jìn)行探討。
　　建立大鼠慢性氧中毒模型后，使用相應(yīng)方式進(jìn)行處理，提取肺組織總RNA和蛋白，分別采用Real time PCR和Western Blot檢測(cè)ASK1的mRNA水平和蛋白水平。結(jié)果表明，與HALI組相比，氫氣干預(yù)組ASK1 mRNA水平和蛋白水平均顯著降低，結(jié)果提示，氫氣可通過(guò)抑制氧中

9、毒大鼠肺臟ASK1的基因表達(dá)和蛋白水平發(fā)揮慢性氧中毒保護(hù)作用。
　　最后，進(jìn)一步研究ASK1下游信號(hào)通路分子JNK及P38的表達(dá)變化，深入研究氫氣發(fā)揮保護(hù)作用的分子機(jī)制。提取肺組織總RNA和蛋白后，分別采用Real time PCR和Western Blot檢測(cè)JNK及P38的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氧中毒后JNK和P38的表達(dá)均顯著上調(diào)，與HALI組相比，氫氣干預(yù)可以抑制JNK的mRNA表達(dá)，且pJNK蛋白水平顯著降低

10、，對(duì)于P38而言，與HALI組和氫氣干預(yù)組其mRNA和pP38蛋白水平均無(wú)顯著性差異。該結(jié)果表明，氫氣通過(guò)抑制ASK1的表達(dá)，從而抑制JNK通路而非p38MAPK通路發(fā)揮慢性氧中毒保護(hù)作用。
　　綜上所述，氫氣分子具有電中性、分子量小等特點(diǎn)，容易穿透細(xì)胞膜而進(jìn)入胞內(nèi)以及線粒體中，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)解釋了，氫氣可以顯著降低慢性氧中毒肺損傷，而氫氣的作用機(jī)制可能與抑制 ASK1-JNK信號(hào)通路密切相關(guān)，本課題初步揭示了氫氣保護(hù)效應(yīng)的分子機(jī)