異香蘭酸酰胺類人環(huán)核苷酸磷酸二酯酶4B2(hPDE4B2)抑制劑的設計、合成與篩選.pdf

1、環(huán)核苷酸磷酸二酯酶4（PDE4）專一性水解環(huán)核苷酸磷酸二酯（cAMP），其抑制劑具有抗炎、抗抑郁等重要藥理作用?？├仗m(Rolipram)是最早發(fā)現(xiàn)的人PDE4抑制劑，由于嚴重的副反應僅作為研究試劑?？├仗m含3-位環(huán)戊基取代的異香蘭酸的酰胺母核結構即3-(環(huán)戊氧基)-4-甲氧基苯甲酰胺，此類化合物易于合成，母核部分不含手性結構；現(xiàn)有PDE4抑制劑大多有手性碳原子或復雜雜環(huán)結構，制備難度大。改變異香蘭酸酰胺的氨基端結構并調(diào)節(jié)異香蘭酸3

2、，4-位取代基是設計新型PDE4抑制劑的重要思路。
　　本研究首先根據(jù)文獻報道，選擇對豬 PDE4有較強抑制作用的取代芳胺的異香蘭酸酰胺，合成并評價其對人PDE4的抑制活性。異香草醛（又名異香蘭素）通過烷基化、氧化生成異香蘭酸，直接與氨類衍生物發(fā)生酰化合成了一系列芳香胺的異香蘭酸酰胺化合物。重點嘗試雙氧水在金屬催化劑條件下進行醛的氧化，提高速率與產(chǎn)率；羧酸與胺直接脫水生成酰胺，改脫水劑二環(huán)己基碳二亞胺為O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟

3、磷酸酯（HBTU），提高反應速率和產(chǎn)率，簡化后處理方法。候選抑制劑結構經(jīng)1H-NMR確定。通高效液相色譜確認其純度都高于88％。將人全長酸磷酸二酯酶4B2（hPDE4B2），連接6His-SUMO在大腸桿菌中重組表達，經(jīng)Ni2+-NTA純化獲得hPDE4B2。用已建立的孔雀綠定磷法測定該類化合物對人全長hPDE4B2抑制常數(shù)（Ki），與豬主動脈的PDE4的Ki比較，發(fā)現(xiàn)該類化合物對兩種來源PDE4具有不同結構活性關系。其中，苯胺的苯甲酰

4、胺Ki達納摩爾級。根據(jù)已知化合物結構活性關系，進一步設計合成一系列新型脂肪族小環(huán)胺類的異香蘭酸酰胺，測定其對hPDE4B2的Ki。發(fā)現(xiàn)環(huán)戊胺的異香蘭酸?；a(chǎn)物抑制常數(shù)為亞納摩爾級，具有潛在抗炎活性?？兹妇G定磷法對PDE4抑制劑的高通量篩選需比活大于8 U/g的純酶。大腸桿菌中人全長環(huán)核苷酸磷酸二酯酶4B2（SF-hPDE4B2）的可溶表達豐度低、提純難，而由活性中心組成的人磷酸二酯酶4B2截短突變體152-528（ST-hPDE4B2）

5、表達和純化更容易。當兩個靶酶添加6-His標簽重組表達后，ST-hPDE4B2較SF-hPDE4B2的比活高近30倍，活性收率高100倍。用 ST-hPDE4B2為靶篩選抑制劑可降低成本，須可靠的預測 SF-hPDE4B2的 Ki。比較化合物對 SF-hPDE4B2和ST-hPDE4B2的 Ki，發(fā)現(xiàn)化合物對 SF-hPDE4B2的 Ki均比其對ST-hPDE4B2的小，且雙對數(shù)模型可以描述他們的緊密單調(diào)相關性。此模型以ST-hPDE4