5型磷酸二酯酶抑制劑逆轉(zhuǎn)MRP7介導(dǎo)多藥耐藥的機(jī)理研究.pdf

1、研究背景及目的：化療是癌癥治療中最主要的治療手段，然而腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生了耐藥性是影響化療療效和導(dǎo)致化療失敗的主要原因。腫瘤細(xì)胞耐藥性根據(jù)耐藥譜不同可分為原藥耐藥（Primary Drug Resistance，PDR）和多藥耐藥（Multidrug Resistance，MDR）。MDR是指腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期接觸某一種抗癌藥物后，腫瘤細(xì)胞不僅對(duì)這一種抗癌藥物產(chǎn)生耐藥，而且對(duì)其他結(jié)構(gòu)和功能不同的多種抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥的現(xiàn)象。MDR是目前

2、影響腫瘤患者化療成功的一個(gè)主要障礙。ABC（ATP-binding Cassette）跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族在MDR形成中起主要作用，它們依賴ATP水解成ADP所釋放出來的能量，將結(jié)構(gòu)或作用機(jī)制不同的抗癌藥物通過細(xì)胞膜泵出細(xì)胞外。根據(jù)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族序列的相似性，目前ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族分為7個(gè)亞家族，ABCA~ABCG。其中 P-糖蛋白（ABCB1/P-gp，P-glycoprotein），多藥耐藥相關(guān)蛋白（ABCCs/MRPs，Mu

3、ltidrug Resistance-associated Proteins）和乳腺癌耐藥蛋白（ABCG2/BCRP，Breast Cancer Resistance Protein）過表達(dá)時(shí)MDR形成的主要原因。P-gp是最早發(fā)現(xiàn)、研究最為深入的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它能輸送多種疏水性化合物，其中常見的包括紫杉烷類、蒽環(huán)類和長(zhǎng)春花生物堿類的抗癌藥物。MRP7是多藥耐藥相關(guān)蛋白家族中的一員，在對(duì)紫杉烷類和長(zhǎng)春花生物堿類天然抗癌藥物耐藥方面與 P-g

4、p相類似，MRP7與P-gp可共同參與腫瘤細(xì)胞對(duì)相同抗癌藥物耐藥的形成。
　　研發(fā)腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑可以抑制起耐藥作用的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能來減少藥物外排，恢復(fù)腫瘤MDR細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。在過去30多年來，很多腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑在體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)具有逆轉(zhuǎn)MDR功能，然而由于逆轉(zhuǎn)劑本身的毒副作用較大或影響抗癌藥物在體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)等原因，至今還沒有腫瘤 MDR逆轉(zhuǎn)劑在臨床上成功運(yùn)用到逆轉(zhuǎn)腫瘤 MDR。有研究發(fā)現(xiàn)，從長(zhǎng)期在臨床上安全使用的

5、藥物中篩選MDR逆轉(zhuǎn)劑也是不錯(cuò)的選擇，可以避免逆轉(zhuǎn)劑在臨床上對(duì)患者產(chǎn)生的毒副作用。最近我們研究發(fā)現(xiàn)5型磷酸二酯酶抑制劑西地那非（Sildenafil）和伐地那非（Vardenafil）能逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的MDR，本文對(duì)PDE5抑制劑是否對(duì)MRP7具有逆轉(zhuǎn)作用進(jìn)行研究。
　　研究方法：
　　1.藥物的細(xì)胞毒性測(cè)定用MTT法；
　　2.細(xì)胞內(nèi)藥物積累實(shí)驗(yàn)和藥物外排實(shí)驗(yàn)用液閃儀檢測(cè)放射性標(biāo)記物[3H]-紫杉醇來測(cè)定細(xì)胞中抗癌

6、藥物的積累水平；
　　3. MRP7蛋白表達(dá)用Western blotting；
　　4. MRP7在細(xì)胞膜上的定位用免疫熒光分析；
　　5.所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3次，各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。滿足正態(tài)性分布且方差齊性的兩組之間差異的比較用兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性檢驗(yàn)時(shí)用非參數(shù)檢驗(yàn)，顯著性水平ɑ=0.05，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.5?mol/L的西地那非，伐地那非和他達(dá)拉非能有效使HEK293-MRP7細(xì)胞耐紫杉醇的倍數(shù)從9.21倍分別下降到1.15，1.06和5.87倍；對(duì)多西他賽的耐藥倍數(shù)從11.31倍分別下降到1.28，1.19和8.35倍；對(duì)長(zhǎng)春堿的耐藥倍數(shù)從5.03倍分別下降到1.28，1.11和3.62倍。
　　2.在藥物積累實(shí)驗(yàn)中，西地那非，伐地那非和他達(dá)拉非能明顯地增加HEK-MRP7細(xì)胞中

8、的[3H]-紫杉醇的積累，在5?mol/L時(shí)，[3H]-紫杉醇的積累水平分別增加了3.34，3.72和2.08倍。
　　3. HEK293-MRP7細(xì)胞中[3H]-紫杉醇的泵出要顯著高于敏感細(xì)胞HEK293-pcDNA3.1，HEK293-MRP7細(xì)胞中積累的[3H]-紫杉醇被 MRP7外排泵出隨著時(shí)間的增加而增加。當(dāng) HEK293-MRP7細(xì)胞與5?mol/L的sildenafil，vardenafil和tadalafil共同孵

9、育培養(yǎng)后，細(xì)胞中的藥物[3H]-紫杉醇泵出明顯減少。4. Tadalafil對(duì)MRP7介導(dǎo)的MDR的逆轉(zhuǎn)強(qiáng)度、增加HEK-MRP7細(xì)胞中的[3H]-紫杉醇積累的水平和抑制MRP7介導(dǎo)的藥物輸送功能相比sildenafil和vardenafil較弱。
　　5. Sildenafil，vardenafil和tadalafil不影響HEK293-MRP7細(xì)胞中MRP7的表達(dá)和不改變MRP7在細(xì)胞膜上的定位。
　　研究結(jié)論：

10、　　1. Sildenafil和vardenafil有效逆轉(zhuǎn)MRP7介導(dǎo)的紫杉醇、多西他賽和長(zhǎng)春堿耐藥。
　　2. Sildenafil和vardenafil增加[3H]-紫杉醇在HEK293-MRP7中的積累。
　　3. Sildenafil和vardenafil抑制MRP7介導(dǎo)的[3H]-紫杉醇輸送。
　　4. Sildenafil和vardenafil通過抑制MRP7的藥物外排泵功能來逆轉(zhuǎn)MRP7介導(dǎo)的多藥耐藥，