多元質(zhì)粒工程技術(shù)及CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)的建立與應(yīng)用.pdf

1、多元質(zhì)粒工程多元質(zhì)粒工程技術(shù)技術(shù)及CRISPRCas9介導(dǎo)的介導(dǎo)的基因組編輯基因組編輯技術(shù)技術(shù)的建立建立與應(yīng)用應(yīng)用EstablishmentapplicationofmultiplexiterativeplasengineeringCRISPRCas9mediatedgenomeediting（國家973計劃項目資助NO.2011CBA00804，2012CB725203）一級學(xué)科：化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)科專業(yè)：生物化工研究生：李一凡指導(dǎo)教師

2、：趙學(xué)明教授天津大學(xué)化工學(xué)院二零一五年五月中文摘要中文摘要構(gòu)建具有最優(yōu)功能的合成代謝途徑是代謝工程及合成生物學(xué)面臨的一個主要挑戰(zhàn)。本文首先建立了多元質(zhì)粒工程（MultiplexIterativePlasEngineering，MIPE）技術(shù)，可以高效的對構(gòu)建在質(zhì)粒上的代謝途徑進行組合優(yōu)化。MIPE技術(shù)利用多元ssDNA重組向質(zhì)粒中引入突變點，對質(zhì)粒上的多個靶向位點進行組合修飾，通過一個反應(yīng)能夠構(gòu)建107的質(zhì)粒文庫。同時，利用質(zhì)粒DNA和

3、ssDNA共轉(zhuǎn)策略及限制性酶切介導(dǎo)的共篩選（RestrictionDigestionmediatedCoion，RDCoS）策略提高了質(zhì)粒ssDNA重組的效率進而提高了MIPE引入組合突變的能力。作為對MIPE的測試，我們首先利用MIPE優(yōu)化含有5個基因的核黃素代謝途徑，在一周時間內(nèi)將核黃素產(chǎn)量提高了2.67倍。之后，我們利用MIPE同時靶向750bp的紅色熒光蛋白的23個密碼子，在文庫中實現(xiàn)了31%的密碼子的平均突變率。之后，我們基于

4、CRISPRCas9在大腸桿菌中建立一個快速、高效、可循環(huán)的基因組編輯系統(tǒng)，從而為在基因組上快速、便捷的優(yōu)化代謝途徑提供了一個有價值的工具。這項技術(shù)能夠以接近100%的編輯效率進行基因敲除和插入等多種遺傳操作，并且能夠同時插入三個突變點。我們還建立了基于CRISPRCas9的可誘導(dǎo)的質(zhì)粒消除系統(tǒng)，能夠?qū)RNA質(zhì)粒從細胞中消除，從而實現(xiàn)循環(huán)的基因組編輯，每個循環(huán)僅需兩天。同時，我們發(fā)現(xiàn)使用有功能性的錯配修復(fù)系統(tǒng)（mismatchrepa

5、ir，MMR）的野生菌株可以顯著的降低細胞逃脫CRISPR切割的概率，進而提高基因組編輯效率。為了測試這項技術(shù)在代謝工程中的應(yīng)用潛力，我們利用它將β胡蘿卜素合成代謝途徑整合到了大腸桿菌基因組上，并且對甲基赤蘚糖醇4磷酸（methylerythritol4phosphate，MEP）代謝途徑和中心碳代謝途徑進行組合優(yōu)化提高β胡蘿卜素產(chǎn)量。我們一共測試了33個基因組操作，構(gòu)建了超過100個不同的菌株，其中最優(yōu)菌株含有15個基因組修飾，通過分