載體pAAVeG-sgRNa-供體DNA的構(gòu)建及與CRISPR-Cas9共同介導(dǎo)的基因編輯.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建AAV表達(dá)載體pAAVeG-U6gRNA，并根據(jù)不同的受體細(xì)胞設(shè)計(jì)不同的基因編輯模型來(lái)驗(yàn)證新構(gòu)建載體與CRISPR/Cas9共同介導(dǎo)基因編輯的能力。
　　方法:
　　首先通過(guò)基因克隆的方法，將原始的真核表達(dá)載體phU6-gRNA改造成能夠同時(shí)插入gRNA與外源供體DNA的AAV表達(dá)載體pAAVeG-U6gRNA，完成后通過(guò)基因測(cè)序確定改造后的載體序列，并且利用AAV輔助包裝系統(tǒng)(AAV-DJ Helpe

2、r Free Bicistronic System)將其包裝成病毒顆粒后感染肌細(xì)胞，用以檢測(cè)包裝成的病毒顆粒是否有感染能力。其次，為了驗(yàn)證構(gòu)建的pAAVeG-U6gRNA載體基因編輯的功能，我們?cè)O(shè)計(jì)了三個(gè)基因編輯的模型，包括人HFF細(xì)胞Slug基因的刪除模型（pAAVeG-hSlug-g3-g4）、 Mdx模型鼠肌細(xì)胞DMD基因的糾正模型(pAAVeG-Mdx-g3-Donor4)以及Slugtag在鼠C2C12細(xì)胞Slug基因的插入模

3、型（pAAVeG-mSlugtag-gRNA2）。利用AAV輔助包裝系統(tǒng)在293T細(xì)胞系中將各個(gè)模型AAV載體包裝成AAV，然后與表達(dá)CRISPR/Cas9和RFP的腺病毒(AdR-Cas9)共同感染受體細(xì)胞，最終通過(guò)PCR、WesternBlot、藥物篩選及基因組測(cè)序等實(shí)驗(yàn)技術(shù)驗(yàn)證載體pAAVeG-U6gRNA基因編輯功能。
　　結(jié)果:
　　各模型AAV及AdR-Cas9感染的受體細(xì)胞帶有綠色熒光及紅色熒光，表明感染成功，

4、加入病毒液感染48小時(shí)后，用倒置熒光顯微鏡觀察，結(jié)果顯示各受體細(xì)胞的感染效率約為60％。PCR、基因測(cè)序及Western Blot結(jié)果顯示，載體pAAVeG-hSlug-g3-g4成功介導(dǎo)了人HFF細(xì)胞Slug基因的刪除;載體pAAVeG-Mdx-g3-Donor4成功介導(dǎo)了Mdx模型鼠肌細(xì)胞DMD基因的糾正;載體pAAVeG-mS lugtag-gRNA2成功介導(dǎo)Slugtag外源供體基因在鼠C2C12細(xì)胞Slug基因中的插入。