CRISPR-Cas9技術(shù)介導(dǎo)miR167前體序列編輯體系的建立.pdf

1、中國作為世界柑橘的重要生產(chǎn)國之一，栽培歷史悠久，品種資源豐富。柑桔的無核育種目前仍然以常規(guī)育種為主，基于雜交的傳統(tǒng)育種手段耗時(shí)長且難以滿足定向改良的需求，芽變、實(shí)生選種及誘變育種的成功率較低，產(chǎn)生的突變有一定的隨機(jī)性。近年來基因工程育種作為一種重要輔助手段在柑橘遺傳改良中得到應(yīng)用，基因工程育種可以根據(jù)人們的意愿定向改造生物目標(biāo)遺傳特性，創(chuàng)造出新的種質(zhì)資源，但是轉(zhuǎn)基因技術(shù)引發(fā)了很多爭議，因有外源基因的插入問題，目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)安全性受到公眾

2、的廣泛重視。CRISPR/Cas9技術(shù)作為一門新興的第三代基因編輯技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)在基因組水平上對(duì)目標(biāo)基因定點(diǎn)修飾，并且有研究表明其產(chǎn)生的突變可以遺傳給下一代，近些年來 CRISPR/Cas9技術(shù)逐漸成為研究基因功能的一種新方法。microRNAs（miRNAs）是一類長度約為19-26 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞中，植物microRNA主要通過直接剪切或抑制翻譯的方式對(duì)靶基因mRNA發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。先前的

3、研究表明，一些 miRNAs在不同物種之間都具有序列和功能上的保守性，它們主要參與調(diào)控植物器官的形態(tài)建成和生長發(fā)育、植物逆境脅迫反應(yīng)、植物激素調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及其他重要的生物過程。植物 miR167是一類保守的 miRNA，它的靶基因有轉(zhuǎn)錄因子ARF6和ARF8，主要參與調(diào)控植物花和果實(shí)發(fā)育相關(guān)的過程。
　　本研究初步探索了利用 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)對(duì)柑橘和番茄 miR167a前體序列進(jìn)行編輯，以期運(yùn)用該

4、技術(shù)開展柑橘無核種質(zhì)的創(chuàng)制，并對(duì)miR167a的功能進(jìn)行研究。本研究主要取得的研究結(jié)果如下：
　　1、利用miRBase數(shù)據(jù)庫搜索并下載出番茄sly-miR167a以及柑橘csi-miR167a的成熟序列和前體序列，分別與NCBI中柑橘和番茄基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，找到它們相應(yīng)的基因組DNA序列。通過對(duì)柑橘csi-miR167a和番茄sly-miR167a成熟序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)兩者同源性很高，說明 miR167a在柑橘和番

5、茄中的成熟序列保守性較好。同時(shí)比對(duì)兩者的前體序列后發(fā)現(xiàn)存在一定的差異，說明miR167a在柑橘和番茄中的前體序列保守性較差。
　　2、針對(duì)柑橘csi-miR167a前體序列和番茄sly-miR167a前體序列，利用在線軟件分別設(shè)計(jì) gRNA位點(diǎn)，分別是 csi-gRNA和 sly-gRNA，并且成功構(gòu)建了重組pKSE401和pP1C.1C兩種類型的CRISPR/Cas9表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，進(jìn)行柑橘上胚軸莖段和番

6、茄子葉的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。在番茄的遺傳轉(zhuǎn)化中，經(jīng)過抗性篩選和PCR檢測(cè)，鑒定到67株轉(zhuǎn)pKSE401載體的再生植株，經(jīng)過PCR產(chǎn)物測(cè)序分析，與野生型植株的基因序列進(jìn)行對(duì)比，靶標(biāo)位點(diǎn)區(qū)域未發(fā)現(xiàn)堿基差異。對(duì)于轉(zhuǎn) pP1C.1C載體的番茄材料，得到含熒光標(biāo)記的愈傷組織，測(cè)序結(jié)果顯示靶標(biāo)位點(diǎn)區(qū)域仍然沒有發(fā)生基因編輯。進(jìn)一步通過 gRNA靶點(diǎn)效率體外檢測(cè)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) gRNA靶標(biāo)位點(diǎn)體外酶切效率不高，由此推測(cè)番茄的遺傳轉(zhuǎn)化材料中沒有發(fā)生基因編輯情況，原

7、因在于gRNA位點(diǎn)的設(shè)計(jì)有缺陷。
　　3、改進(jìn)試驗(yàn)后，我們使用在線軟件和體外檢測(cè)相結(jié)合的方式設(shè)計(jì)gRNA靶標(biāo)位點(diǎn)，在線軟件對(duì)番茄sly-miR167a前體的同源序列設(shè)計(jì)多個(gè)gRNA靶標(biāo)位點(diǎn)，再通過體外切割效率檢測(cè)，最終驗(yàn)證得到體外切割成功的 gRNA——G1。構(gòu)建pP1C.1C表達(dá)載體后，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄，得到3個(gè)有熒光標(biāo)記的突變體材料。測(cè)序分析結(jié)果表明，3個(gè)突變體材料在基因組靶標(biāo)位點(diǎn)區(qū)域均出現(xiàn)不同類型的堿基突變，主要是堿