涼血化瘀方對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞凋亡及其吞噬作用影響的研究.pdf

1、目的：
　　 以唐由之研究員經(jīng)驗方?jīng)鲅龇綖楦深A藥物,觀察不同濃度涼血化瘀方中藥及服用了不同劑量涼血化瘀方中藥的大鼠血清(含藥血清)對藍光誘導體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞凋亡的影響；及該藥物對人視網(wǎng)膜色素上皮細胞吞噬作用的影響。從細胞生物學角度探討涼血化瘀方對年齡相關性黃斑變性的療效機制,為涼血化瘀方治療濕性年齡相關性黃斑變性提供實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1人RPE細胞的體外培養(yǎng)及鑒定:用胰酶

2、消化法體外分離人RPE細胞,進行RPE細胞的原代及傳代培養(yǎng),并觀察細胞生長情況。采用免疫組化法對細胞進行鑒定。
　　 2適于人RPE細胞實驗的涼血化瘀方藥物濃度的篩選:用CCK8法測定加入不同濃度涼血化瘀方中藥粗提物及不同劑量的不同濃度涼血化瘀方含藥血清共同培養(yǎng)的人RPE細胞的吸光度值,觀察不同濃度涼血化瘀方中藥及不同劑量的不同濃度涼血化瘀方含藥血清對人RPE細胞活性的影響。選擇適合進行人RPE細胞相關實驗的藥物濃度。
　

3、　 3人RPE細胞光損傷模型的建立:采用波長范圍為470～500nm,光照強度為(2000±500)LUX的藍光對人RPE細胞進行照射12小時,誘導人RPE細胞凋亡。采用流式細胞技術,以AnnexinⅤ FITC/PI為染料觀察人RPE細胞的凋亡情況。
　　 4涼血化瘀方對藍光誘導的人RPE細胞凋亡的影響:光照前加入不同濃度涼血化瘀方中藥粗提物、不同劑量的不同濃度涼血化瘀方含藥血清及陽性對照藥物(維生素C100umol/L)。

4、采用流式細胞技術,以AnnexinⅤ FITC/PI為染料,檢測不同濃度的中藥粗提物及不同劑量的不同濃度涼血化瘀方含藥血清對藍光誘導的人RPE細胞凋亡的影響。并與陽性對照組進行比較。
　　 5涼血化瘀方對人RPE細胞吞噬作用的影響:用FITC標記光感受器外節(jié)膜盤(rod outer segment,ROS)；用DAPI將細胞染色并進行細胞計數(shù)；將不同濃度涼血化瘀方中藥粗提物及不同劑量的不同濃度涼血化瘀方含藥血清干預的后的人RPE

5、細胞與標記好的ROS共同培養(yǎng)12小時后；熒光顯微鏡照相,用Leica QWIN圖像分析軟件分別測量藥物干預后的RPE細胞平均吞噬FITC標記后的ROS的熒光面積。
　　 結果：
　　 1人RPE細胞的培養(yǎng)及鑒定:原代人RPE細胞培養(yǎng)過程中,體外分離的人RPE細胞在2～3天內可貼壁生長,生長一周左右出現(xiàn)細胞集落,10天左右大部分細胞呈現(xiàn)融合狀態(tài)。原代人RPE細胞呈扁平、不規(guī)則多角形,細胞核及核仁呈透明狀,胞漿內充滿黑色素顆

6、粒,由于其自身不能產(chǎn)生黑色素,隨著傳代次數(shù)的增加,胞漿內黑色素顆粒逐漸減少直至消失。傳至第五代,細胞呈梭型,類似成纖維細胞。傳代至第九代細胞出現(xiàn)增殖緩慢。免疫組化法進行細胞鑒定,S100、CK均為陽性即胞漿均呈棕黃色,未見陰性細胞。
　　 2適于人RPE細胞實驗的涼血化瘀方藥物濃度的篩選:觀察不同濃度涼血化瘀方中藥粗提物及不同劑量的不同濃度涼血化瘀方含藥血清對人RPE細胞活性的影響。結果示:終濃度為2mg/ml、200ug/ml

7、、20ug/ml、2ug/ml的涼血化瘀方中藥粗提物組與未加藥物組RPE細胞吸光度(OD)值比較未見明顯降低,無統(tǒng)計學意義(P>0.05),即這四個濃度的涼血化瘀方中藥對人RPE細胞活性無影響,可以用于實驗研究。終濃度為200mg/ml、20mg/ml組與未加藥物組RPE細胞吸光度(OD)值比較明顯降低,具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),抑制RPE細胞的活性,不適宜進行實驗；終濃度為10％、20％、30％、40％的高、中、低劑量涼血化瘀方

8、含藥血清的RPE細胞組與無藥血清組RPE細胞比較吸光度(OD)值比較未見明顯降低,無統(tǒng)計學意義(P>0.05),即對人RPE細胞的活性無明顯的影響,可以用于實驗。
　　 3人RPE細胞光損傷模型的建立:波長范圍為470～500nm,光照強度(2000±500)LUX的藍光照射人RPE細胞12小時,對RPE細胞的影響主要是細胞凋亡,藍光照射可以成功建立RPE細胞光損傷模型。
　　 4涼血化瘀方對藍光誘導的人RPE細胞凋亡的

9、影響:用Annexin V FITC/PI雙染,流式細胞儀檢測不同濃度涼血化瘀方中藥粗提物及不同劑量的不同濃度涼血化瘀方含藥血清對藍光誘導的人RPE細胞凋亡的影響。中藥粗提物部分實驗的結果示:在2mg/ml、200ug/ml、20ug/ml、2ug/ml的濃度范圍內對藍光誘導的人RPE細胞凋亡具有保護作用,凋亡細胞數(shù)量明顯少于光損傷組,具有統(tǒng)計學意義(P<0.01),且優(yōu)于陽性對照藥組(維生素C組)。含藥血清部分實驗結果示:高、中、低劑

10、量含藥血清的40％、20％、1096、5％濃度組均對藍光誘導的人RPE細胞凋亡具有保護作用。其中濃度為40％、20％高劑量含藥血清組及濃度為40％、20％、10％中劑量含藥血清組和濃度為40％、20％低劑量含藥血清組,對藍光誘導的人RPE細胞凋亡的保護作用優(yōu)于陽性對照組,凋亡細胞數(shù)量明顯少于陽性對照組,具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)；濃度為10％、5％高劑量含藥血清組對藍光誘導的人RPE細胞凋亡的保護作用優(yōu)于陽性對照組,凋亡細胞數(shù)量

11、明顯少于陽性對照組,具有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.05)；濃度5％的中劑量組及濃度為10％和5％低劑量組與陽性對照組比較細胞凋亡數(shù)量無明顯差異(P>0.05)。涼血化瘀方對藍光誘導的人RPE細胞凋亡的保護作用在一定濃度范圍內與藥物濃度高低呈正比。在本實驗研究的濃度范圍內隨著藥物濃度的增加保護作用越明顯。
　　 5涼血化瘀方對人RPE細胞吞噬作用的影響:中藥粗提物部分實驗的結果示:濃度為2mg/ml,200ug/ml組,人RPE細胞

12、平均吞噬ROS的熒光面積明顯大于未干預組(P<0.01)即其吞噬ROS數(shù)量多于未干預組；20ug/ml組,2ug/ml組相對于未干預組吞噬ROS熒光面積未見明顯差異(P>0.05)。含藥血清部分實驗結果顯示:高、中、低劑量含藥血清濃度為40％的三個藥物干預組的人RPE細胞平均吞噬ROS的熒光面積明顯大于未干預組(P<0.01)即其吞噬ROS數(shù)量多于未干預組；余各組相對于未干預組人RPE細胞平均吞噬ROS的熒光面積未見明顯差異。本實驗結果

13、表明涼血化瘀方在較高的濃度范圍內對人RPE細胞的吞噬功能有一定的促進作用。
　　 結論：
　　 1胰酶消化法是成功的體外純化培養(yǎng)人RPE細胞的有效方法,為建立RPE細胞相關實驗模型,進行相關實驗提供基礎。
　　 2涼血化瘀方在本實驗的濃度范圍內對藍光誘導的人RPE細胞凋亡具有一定的保護作用。
　　 3涼血化瘀方在本實驗的涉及的較高的濃度內有提高人RPE細胞的吞噬功能的作用。
　　 4涼血化瘀方對藍