改性聚(D,L-乳酸)與MC3T3-E1細(xì)胞的生物相容性.pdf

1、聚乳酸材料是具有良好生物相容性的合成生物可降解材料。采用馬來酸酐和丁二胺依次對聚（DL-乳酸）（DLPLA）進(jìn)行化學(xué)改性，以提高材料的親水性，消除或減弱聚乳酸降解產(chǎn)物的酸性，促進(jìn)材料與細(xì)胞之間的粘附，從而提高材料的生物相容性。在合成此類改性材料的基礎(chǔ)上，本文采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法，以MC3T3-E1為模型細(xì)胞，將細(xì)胞與各基質(zhì)材料復(fù)合培養(yǎng)，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞附著與鋪展、細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期、細(xì)胞生理功能以及I型膠原和OPN表達(dá)等方面考查細(xì)胞在丁

2、二胺改性聚乳酸（DPLA）、馬來酸酐改性聚乳酸（MPLA）和DLPLA上的細(xì)胞行為，綜合評價DPLA、MPLA和DLPLA與MC3T3-E1的生物相容性，為進(jìn)一步的動物體內(nèi)實驗和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)主要工作和結(jié)論如下：
　　（1）材料的合成及其性能評價：將聚乳酸（DLPLA）沿馬來酸酐改性——脂肪族二胺改性的路線依次進(jìn)行整體修飾，從而制備出新型仿生聚乳酸基質(zhì)材料。其中，馬來酸酐的引入主要是給材料提供高反應(yīng)活性的酸酐鍵；二胺的引入主

3、要是為了克服聚乳酸材料降解產(chǎn)物呈酸性的缺陷。采用羅丹明比色法、茚三酮顯色法和氨基酸分析儀檢測法對產(chǎn)物中的馬來酸酐、二胺進(jìn)行定量測定。采用靜態(tài)水接觸角和吸水率對材料的親/疏水性能進(jìn)行評價
　?。?）細(xì)胞培養(yǎng)：采用體外細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)前成骨細(xì)胞系 MC3T3-E1細(xì)胞；MC3T3-E1細(xì)胞常用于骨組織工程支架的生物相容性評價[1]，是目前被廣泛用于研究材料骨誘導(dǎo)能力的細(xì)胞系之一，可以用于材料上細(xì)胞相容性比較的實驗研究。
　?。?）

4、細(xì)胞在基底材料上的黏附和鋪展：相差顯微鏡觀察細(xì)胞與基底材料復(fù)合培養(yǎng)4h,8h,24h的生長情況，并拍照記錄。采用HE染色技術(shù)觀察MC3T3-E1細(xì)胞與基底材料上復(fù)合培養(yǎng)3d后的生長情況，并照相記錄。實驗結(jié)果表明：DPLA組的細(xì)胞密度高于MPLA組和DLPLA，而且DPLA組材料基底上的細(xì)胞形態(tài)呈三角形或短梭形，相對而言，MPLA和DLPLA上生長的細(xì)胞密度較小，表明細(xì)胞在DPLA上的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)優(yōu)于在MPLA和DLPLA的。就細(xì)胞形態(tài)學(xué)表

5、現(xiàn)而言，DPLA具有比MPLA和DLPLA更好的細(xì)胞相容性。而且不同接枝率的DPLA對細(xì)胞形態(tài)有影響，接枝率高的改性材料更有利于細(xì)胞的鋪展；采用微吸管吸吮技術(shù)測細(xì)胞與基底材料復(fù)合培養(yǎng)0.5h和4h后的黏附力大小。實驗結(jié)果表明：DPLA更有利于細(xì)胞的黏附，且高含量的丁二胺改性材料更有利于細(xì)胞的黏附與鋪展。
　?。?）采用MTT法測定MC3T3-E1細(xì)胞接種在基質(zhì)材料上后第2、4、6、8天的細(xì)胞增殖存活能力，繪出生長曲線；通過流式細(xì)胞

6、儀對與三種材料復(fù)合培養(yǎng)72h后細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力及生長曲線因培養(yǎng)基底材料不同而不同。細(xì)胞在各組材料上都具有增殖能力，其中，在 DPLA上的細(xì)胞活性顯著大于在MPLA和DLPLA上的，MPLA組的要大于在DLPLA上的。DPLA能使進(jìn)入分裂前期（G2/M）及分裂期（S）的細(xì)胞增多,而MPLA、DLPLA對細(xì)胞周期的影響較小,表明DPLA促進(jìn)了細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖。在促進(jìn)增值分裂方面，DPLA具有比MP

7、LA和DLPLA更好的細(xì)胞相容性。高接枝率的丁二胺改性材料在促進(jìn)細(xì)胞增殖跟分裂方面效果更好。
　?。?）采用BCA法，測定細(xì)胞與材料復(fù)合培養(yǎng)第5、10、15天后總蛋白質(zhì)含量，比較三種材料對細(xì)胞活性的影響，采用酶動力法測定細(xì)胞在基底材料上第7、14、21天的堿性磷酸酶（ALP）活性。通過比色法對基底材料上細(xì)胞培養(yǎng)第5、10、15天鈣含量進(jìn)行測定。實驗結(jié)果表明，培養(yǎng)第5天總蛋白含量DPLA高于其他組，MPLA組大于DLPLA組。培養(yǎng)第

8、10天各組蛋白質(zhì)含量增加明顯；在各時間點，DPLA的堿性磷酸酶強度要高于其他材料組；在培養(yǎng)7天后，DPLA組細(xì)胞分泌的無機(jī)鈣水平高于其他組，DPLA促進(jìn)了細(xì)胞成骨作用這一重要功能活動。以細(xì)胞生理功能而論，DPLA要比MPLA和DLPLA具有更好的細(xì)胞相容性。
　?。?）采用RT-PCR法檢測MC3T3-E1細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)情況。采用Western blot法檢測MC3T3-E1細(xì)胞Ⅰ型膠原和骨橋素（OPN）的表達(dá)情況。結(jié)