不同門脈高壓模型犬的舌下絡脈特征及其形成機制研究.pdf

1、研究背景
　　 舌診是中醫(yī)獨具特色的診法之一，為臨床診斷不可或缺的依據(jù)。舌下絡脈作為中醫(yī)舌診的重要組成部分，因其顯露易見，成為觀察人體氣血、津液盈虧和瘀血的重要指征。近年來在心血管病、消化系統(tǒng)疾病、糖尿病及惡性腫瘤等的中醫(yī)診治中得到廣泛應用。課題組在長期原發(fā)性肝癌的中西醫(yī)結合臨床中發(fā)現(xiàn)，肝癌患者多伴有舌下絡脈的擴張、迂曲等形態(tài)及青紫、絳紫等顏色變化，這種變化非常靈敏，且多與患者的病情進展和治療預后明顯相關。根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，肝通

2、過其經絡直接與舌相連，故肝的異常可在舌上出現(xiàn)相應的改變。但對于異常舌下絡脈形成的分子機制，目前尚鮮有報道，對肝癌異常舌象的研究就更少之又少。既往研究認為，異常舌下絡脈形成可能與舌的靜脈壓力升高有關，但我們工作中注意到肝癌患者伴有門靜脈壓增高者更易出現(xiàn)舌下絡脈異常，通過對肝癌患者的舌下絡脈變化與肝門脈血管及其局部血液動力學指標的檢測也證實了二者存在密切的關系。另有學者通過臨床研究證實，門脈高壓癥患者的舌下絡脈曲張率高達100％。在此基礎上

3、，我們提出了“舌下絡脈和肝門靜脈作為人體靜脈血管系統(tǒng)的組成部分，二者在病理上必然存在密切的內在聯(lián)系”這一假說。而門脈高壓的形成存在肝外阻塞、肝內阻塞和肝外肝內復合阻塞三種類型，不同的門脈高壓形成機制是否會導致舌下絡脈的的不同的變化。繼續(xù)的臨床觀察注意到肝癌伴有的肝硬化病理可以引起舌下絡脈的顏色及性狀異常，而如果患者門脈高壓系繼發(fā)于門脈血管受到腫瘤侵犯之后（門脈癌栓），其舌下絡脈更具有根底部粗張迂曲、絡脈周圍瘀血細絡增多，出現(xiàn)新的小血管等

4、自身特點，這很難簡單地用門靜脈壓力增高引起舌下絡脈被動擴張來完整解釋，進一步提示不同門脈高壓的形成機制，同樣引起了舌下絡脈構型上的多樣性。
　　 而且，引起二者舌下絡脈構型差異的背后必然存在著并不完全一致的分子機制。
　　 成體中血管的形成主要依賴于生理性和病理性的血管生成機制，近年來許多研究也已證實，在門靜脈高壓癥過程中，肺臟和脾臟中均存在血管生成現(xiàn)象。舌下絡脈作為全身靜脈的一部分，其異常改變極可能與機體的血管生成現(xiàn)象

5、存在內在聯(lián)系。因此我們設想根據(jù)“血管生成”理論，重點從血管生成的角度，探討不同門脈高壓模型異常舌下絡脈形成的可能分子機制。許多分子在血管生成中起著正向調節(jié)作用，血管內皮生長因子（Vascular EndotheliAlGrowth Factor，VEGF）是近年來發(fā)現(xiàn)的參與血管生成的最主要的分子。缺氧反應、機械應力等多種機制均可通過激活VEGF/VEGFR信號通路調節(jié)血管生成。新近研究發(fā)現(xiàn)，脂肪炎癥因子及其受體Apelin/APJ通路的

6、調節(jié)與血管生成也有密切聯(lián)系，可能與VEGF/VEGFR信號通路存在“串話”并起到協(xié)同作用，可以看作是治療門脈高壓新的靶點。
　　 研究目的
　　 本研究通過復制肝前型、肝內型、復合型三種門脈高壓犬模型，觀察模型犬舌下絡脈的整體和微觀變化，并從血管生成的角度，重點探尋VEGF/ VEGF2 型受體（vascular endotheliAlgrowth factor receptor 2, VEGFR2）及Apelin/AP

7、J信號通路與異常舌下絡脈形成之間的關系，為揭示異常舌下絡脈形成的分子機制提供數(shù)據(jù)支持。
　　 研究方法
　　 （1）三種門脈高壓犬模型的制備將Beagle 犬隨機分為正常組、假手術組和模型組。以門靜脈窄縮術復制肝前型門脈高壓模型；以二甲基亞硝胺（dimethylnitrosamine，DMN）連續(xù)給藥誘導肝硬化制備肝內型門脈高壓犬模型；以上兩種方法結合復制復合型門脈高壓模型。經皮下留置針以生物電記錄系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測其門脈壓力

8、通過血清肝功能測定和肝臟組織病理學觀察進行成模檢測。
　　 （2）三種門脈高壓模型犬舌下絡脈的特征觀察檢測成模后，肉眼觀察舌下絡脈形態(tài)和顏色變化；游標卡尺測量舌底根部絡脈寬度；動物處死后，取舌底組織，免疫組織化學顯色法檢測舌底組織毛細血管密度；
　　 透射電鏡觀察舌下絡脈的內皮細胞形態(tài)學變化。
　　 （3）三種門脈高壓模型犬異常舌下絡脈的形成機制研究硝酸還原酶法檢測血清一氧化氮（nitric oxide, NO）

9、濃度；Elisa 法檢測血清VEGF及其VEGFR2、缺氧誘導因子1α（Hypoxia-induciable factor 1-α， HIF-1α）濃度；免疫組織化學顯色法和Western blot 法檢測犬舌下VEGF、VEGFR2、HIF-1α、Apelin、APJ蛋白表達；Real-time PCR 法檢測VEGF、VEGFR2、HIF-1αmRNA的表達量。
　　 結果
　　 （1）三種門脈高壓犬模型的制備與假手

10、術組比較，肝內型組和復合型組各實驗犬在DMN 誘導2周門靜脈壓力即開始升高(P<0.05)，隨實驗進展模型組門靜脈壓力在4周、6周、8周呈階梯狀上升(P<0.01)，8周后肝內型組門脈壓力持續(xù)穩(wěn)定，復合型組在進一步行門脈窄縮術后壓力進一步升高(P<0.01)；肝前型組在行門脈窄縮術后，門脈壓力迅速升高達峰值后逐漸下降后，處死前仍然處于較高水平(P<0.01)。另外，與正常組和假手術組比較，三個模型組實驗犬的的肝臟組織學和（或）肝功能出現(xiàn)

11、不同程度的異常改變，顯示模型復制成功。
　　 （2）三種門脈高壓模型犬舌下絡脈的特征觀察肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，肝內型門脈高壓組和復合型組模型犬舌下絡脈形態(tài)較正常組和假手術組迂曲粗大，血管周圍出現(xiàn)瘀點和細絡，顏色變暗變紫，舌根部絡脈直徑明顯增粗(P<0.01)，肝前型門脈高壓組犬僅絡脈顏色變暗，舌根部絡脈直徑增粗不明顯；與正常組和假手術組比較，免疫組化結果顯示三個模型組實驗犬舌底CD31表達均顯著增加(P<0.01)，以復合型組增加最為明

12、顯；透射電鏡顯示，三個模型組實驗犬血管壁全部或局部增厚，管腔變小，出現(xiàn)新的毛細血管，內皮細胞膜界限不清，細胞核損失甚或消失，復合型組改變程度最重，肝內組次之，肝前型組改變較小。
　　 （3）三種門脈高壓模型犬異常舌下絡脈的形成機制研究與正常組和假手術組比較，三種模型組實驗犬血清NO濃度明顯升高(P<0.01)；
　　 肝內型組和復合型組血清VEGF、HIF-1α濃度明顯升高(P<0.01)，肝前型組升高不明顯；三種模型組

13、實驗犬舌底組織VEGF、VEGFR2、HIF-1α蛋白表達均顯著升高(P<0.05)，趨勢為復合型組>肝內型組>肝前型組；舌底組織VEGF、VEGFR2、HIF-1α的mRNA表達量也較正常組和假手術組明顯升高，趨勢與蛋白表達一致；Apelin、APJ蛋白表達也較正常組和假手術組明顯升高(P<0.05)，以復合型組表達增多最為明顯，肝內型次之，肝前型升高較小。結論肝前型、肝內型、復合型三種門脈高壓模型犬舌下絡脈均從宏觀和微觀方面出現(xiàn)相應