轉(zhuǎn)錄因子CREB靶向調(diào)節(jié)SKA2影響腎癌細(xì)胞的增殖.pdf

1、研究目的：
　　本研究探索CREB對(duì)腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)增殖中的影響，以及紡錘體與動(dòng)粒相關(guān)復(fù)合物2(Spindle and kinetochore associated complex2，SKA2)在此過(guò)程中的作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.用QRT-PCR和蛋白印記(Western blot)檢測(cè)CREB在腎癌病人癌組織、癌旁組織及腎癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平；2.利用RNA干擾(R

2、NAi)技術(shù)，瞬轉(zhuǎn)siCREB降低細(xì)胞內(nèi)CREB的表達(dá)水平后，觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響；3.用生物信息學(xué)分析和CHIP實(shí)驗(yàn)探討SKA2是否為CREB的下游靶基因；4.用QRT-PCR和Western blot檢測(cè)SKA2在腎癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平、降低SKA2的表達(dá)后對(duì)腎癌細(xì)胞增殖的影響、轉(zhuǎn)染CREB高表達(dá)質(zhì)粒（pCI-neo/CREB）后，研究其是否逆轉(zhuǎn) siSKA2調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期阻滯；5.設(shè)計(jì)針對(duì) CREB的短發(fā)卡 RNA(s

3、hRNA)，通過(guò)慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)CREB的OS-RC-2細(xì)胞系，觀察其對(duì)裸鼠皮下成瘤能力和瘤塊內(nèi) SKA2蛋白表達(dá)的影響；6.用QRT-PCR檢測(cè)腎癌組織及癌旁組織內(nèi)SKA2的表達(dá)、用皮爾森相關(guān)分析法分析 CREB和 SKA2在組織中二者的相關(guān)性、最后用免疫組化法分析166例臨床標(biāo)本中CREB和SKA2的蛋白表達(dá)及定位、并用斯皮爾曼相關(guān)分析法分析二者關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　(1)腎癌組織和細(xì)胞中CREB的表達(dá)水平

4、顯著性高于對(duì)照；
　　(2) siCREB降低細(xì)胞內(nèi)CREB的表達(dá)后，顯著性抑制了腎癌細(xì)胞的增殖;
　　(3)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，降低細(xì)胞內(nèi) CREB水平后伴隨著 SKA2蛋白表達(dá)的降低；此外，CHIP實(shí)驗(yàn)也證實(shí)SKA2是CREB的靶基下游因；
　　(4)降低細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的SKA2后，能顯著性抑制細(xì)胞的增殖；然而，高表達(dá)CREB后能逆轉(zhuǎn)siSKA2處理引起的細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞分裂中期停滯；
　　(5)裸鼠皮下注射攜帶有

5、低表達(dá) CREB的腫瘤細(xì)胞后，瘤塊大小顯著性低于對(duì)照；此外，瘤塊組織內(nèi)SKA2基因和蛋白的表達(dá)也被顯著性抑制；
　　(6)分析166例臨床組織標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，同一病人組織中SKA2和CREB的mRNA水平呈顯著性正相關(guān)；二者的染色強(qiáng)度都隨著腎癌分期惡性程度的增加而增加。
　　結(jié)論：
　　CREB在腎癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)；降低細(xì)胞內(nèi)CREB的表達(dá)可以在體內(nèi)外抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)制是通過(guò)降低周期相關(guān)蛋白SKA2的表達(dá)；低表達(dá)