人顆粒體蛋白hGRN A的克隆、表達(dá)及抗腫瘤活性研究.pdf

1、多肽在許多生理過程中發(fā)揮著重要作用，多肽類藥物在臨床上已經(jīng)用于治療多種人類疾病。因為來源于人體的多肽幾乎沒有免疫原性，因此，多年來研究人員試圖從人體中尋找具有治療作用的多肽，包括抗癌多肽。有一些來源于人體的多肽/蛋白類藥物，例如干擾素和白介素等，已經(jīng)被成功用于臨床治療人類癌癥，然而這些多肽對癌細(xì)胞的生長沒有直接抑制作用，通常是通過調(diào)節(jié)免疫功能來影響腫瘤的生長。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)人顆粒體蛋白A(hGRN A)具有直接抑制腫瘤生長的能力。

2、這一結(jié)果初步說明，hGRNA具有成為抗腫瘤藥物的潛力。
　　顆粒體蛋白，也被稱為上皮蛋白，由于它們都含有多個半胱氨酸殘基并且擁有多種多樣的功能，因此構(gòu)成了GRN家族。GRN家族中的所有蛋白質(zhì)都包含12個半胱氨酸殘基，并且以高度保守的位置排列。這些由半胱氨酸殘基所形成的二硫鍵構(gòu)成了復(fù)雜的特征結(jié)構(gòu)。GRN A是一個分子量為6 kD、對于酸和熱都穩(wěn)定的多肽。GRN存在于多種生物體，從古細(xì)菌到哺乳動物中都存在。研究表明，GRN A在上皮細(xì)

3、胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)存在，對腫瘤發(fā)生、免疫、神經(jīng)功能方面起著至關(guān)重要的作用。
　　本研究構(gòu)建了表達(dá)載體，成功將hGRN A基因插入酵母基因組中，實現(xiàn)了重組hGRN A在真核系統(tǒng)中的表達(dá);利用重組hGRN A攜帶的組氨酸標(biāo)簽與鎳柱的親和作用純化重組hGRN A;優(yōu)化發(fā)酵條件，提高蛋白收率;用MTT法測定重組hGRN A對幾種人腫瘤細(xì)胞的抑制率;DAPI染色觀察重組hGRN A作用于人腫瘤細(xì)胞后細(xì)胞核的形態(tài)變化;用流式細(xì)胞術(shù)來驗證重組hGRN A

4、對人腫瘤細(xì)胞的直接抑制作用。主要研究結(jié)果如下:
　　1.hGRN A表達(dá)載體構(gòu)建。將hGRN A基因重組到載體pGAPZαA中，成功構(gòu)建了表達(dá)載體pGAPZαA-GRNA。
　　2.表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。將線性化的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入酵母表達(dá)菌SMD1168H中，利用表達(dá)載體攜帶的Zeocin抗性基因，用不同濃度的抗生素對重組克隆進行篩選，最后實驗確定當(dāng)抗生素Zeocin濃度為100μg/mL時表達(dá)量高的克隆。
　　3.發(fā)酵條件優(yōu)化。

5、從培養(yǎng)基成分、接種量、發(fā)酵時間以及發(fā)酵溫度來優(yōu)化發(fā)酵條件，確定培養(yǎng)基成分為酵母粉1％、蛋白胨2％、葡萄糖2％、KH2PO40.4％、(NH4)2SO40.2％、MgSO40.05％，添加磷酸鹽緩沖液使其終濃度為0.1 mol/L;接種量7％，發(fā)酵時間96h，發(fā)酵溫度25℃。采用優(yōu)化后的發(fā)酵條件，使蛋白產(chǎn)量從5 mg/L提高到9.8 mg/L。
　　4.hGRN A的分離純化。利用組氨酸與鎳柱的親和作用純化hGRN A，用20mmo

6、l/L咪唑洗滌雜蛋白，用250 mmol/L咪唑洗脫目的蛋白，實驗得到純化的重組hGRN A。
　　5.hGRN A對腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用。用MTT法測定重組hGRN A對人腫瘤細(xì)胞的抑制率，對PANC-28、HCT-116和BEL-7402細(xì)胞的IC50分別為85.6、100.4和90.9μg/mL，并且結(jié)果表明重組hGRN A抑制腫瘤細(xì)胞增殖具有劑量依賴性。
　　6 hGRN A誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用。(1)DAPI染色觀

7、察細(xì)胞核形態(tài)，加hGRNA組與對照組相比，hGRN A組細(xì)胞核中細(xì)胞質(zhì)固縮、凝聚、出現(xiàn)半月形。隨著hGRN A濃度的增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多;(2)用流式細(xì)胞術(shù)進一步驗證重組hGRN A對腫瘤細(xì)胞的抑制作用，加藥濃度為50、100、150μg/mL時，腫瘤細(xì)胞凋亡率分別為18.52％、44.13％和69.5％，相比對照組9.64％都有顯著性差異(p＜0.05)
　　綜上所述，本研究證明hGRN A對多種人腫瘤細(xì)胞都具有顯著的細(xì)胞