長鏈非編碼RNA-032546、026102在心房顫動犬心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)中的功能及其機制研究.pdf

1、心房顫動（Atrial Fibrillation，AF，房顫）是臨床上最常見的快速型紊亂性房性心律失常，發(fā)病率約0.4％-1％，且隨年齡增長逐年增加。房顫的主要危害為栓子脫落引起的腦卒中及長期快速心室率誘發(fā)的心力衰竭，房顫患者死亡率是竇性心律人群的2倍。盡管藥物、外科手術(shù)及導管射頻消融等治療房顫的手段在不斷發(fā)展，房顫的治療效果仍不盡人意。究其原因，與房顫發(fā)生機制不甚明了密切相關(guān)。
　　長鏈非編碼RNAs（long non-codi

2、ng RNAs，lncRNAs）是一類長度大于200個核苷酸，具有mRNA樣結(jié)構(gòu)，但缺少特異完整開放讀碼框架的轉(zhuǎn)錄本。與mRNAs相比，其表達在不同組織或同一組織的不同生長階段具有明顯的特異性，lncRNAs可從染色質(zhì)重塑、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后加工等多種層面實現(xiàn)對基因表達的調(diào)控，被證實與蛋白質(zhì)、DNAs和RNAs存在相互作用，因其特異性強和功能多樣化，已成為現(xiàn)階段研究的熱點?，F(xiàn)有研究表明，lncRNAs在心血管系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與發(fā)病過程

3、中扮演重要的角色，lncRNAs不僅參與了神經(jīng)元的分化、發(fā)育、突觸可塑性及神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展，且lncRNAs調(diào)控心臟疾病，如心肌梗死、心力衰竭、擴張型心肌病、室間隔缺損等的發(fā)病過程。以上均提示lncRNAs在房顫心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要生物學功能。但何種lncRNAs有異常表達，發(fā)揮何種作用，與房顫的發(fā)生、發(fā)展又有何種關(guān)聯(lián)，尚無系統(tǒng)研究。
　　目的：
　　通過快速右心房起搏建立房顫犬實驗模型，

4、應用高通量測序檢測房顫及非房顫犬心房前右脂肪墊（anterior right fat pads，ARFPs）中差異lncRNAs的表達，并通過一系列生物信息學方法，鑒定與心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)的lncRNAs;通過體內(nèi)、體外實驗，研究lncRNAs對犬心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)及房顫誘發(fā)性的影響;并進一步探討lncRNA-032546和lncRNA-026102影響房顫神經(jīng)重構(gòu)的機理，從lncRNAs的視角研究房顫神經(jīng)重構(gòu)發(fā)生的新機制，對房

5、顫的防治提供新的干預靶點。
　　方法：
　　1、房顫犬模型的建立
　　取6只健康成年比格犬，雌雄不拘，隨機分為對照組和起搏組。兩組均放置起搏電極于右心耳，對照組不起博、喂養(yǎng)4周，起搏組以400次/min起搏4周建立房顫犬模型。為了檢測房顫的發(fā)生，兩組每周均至少行一次體表心電圖。
　　2、驗證神經(jīng)重構(gòu)的發(fā)生
　　取對照組及起搏組犬ARFPs組織，對神經(jīng)細胞胞漿蛋白9.5(protein geneproduct

6、9.5，PGP9.5)行免疫組化染色，計算神經(jīng)密度，驗證房顫介導神經(jīng)重構(gòu)的發(fā)生。
　　3、高通量lncRNA測序并驗證
　　Triol法提取對照組及起搏組犬ARFPs中總RNAs，通過高通量二代測序檢測lncRNAs及mRNAs的差異表達。并隨機選取部分全新的lncRNAs，應用實時定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)的方法，對測序結(jié)果進行驗證。
　　4、篩選與房顫神經(jīng)重構(gòu)

7、相關(guān)的lncRNAs
　　對差異表達的轉(zhuǎn)錄本行Gene Ontology(GO)富集分析及KyotoEncyclopediaof Genes and Genomes(KEGG)通路分析;通過差異性表達倍數(shù)、組織特異性、靶基因預測、文獻檢索等生物信息學方法，篩選并鑒定與神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)的全新lncRNA-032546和lncRNA-026102。
　　5、lncRNA功能缺失實驗
　　1)在體轉(zhuǎn)染
　　體外構(gòu)建lncR

8、NA-032546和lncRNA-026102的沉默慢病毒及對照慢病毒，滴度為1×109 TU/ml。根據(jù)轉(zhuǎn)染慢病毒的不同，15只比格犬隨機分為空白轉(zhuǎn)染組、低表達lncRNA-032546組和低表達lncRNA-026102組，開胸后將相應慢病毒在體斜行注射至ARFPs中，關(guān)胸，10天后處死，免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染效率。
　　2)電生理指標的檢測
　　通過程序電刺激分別于開胸后注射慢病毒前、注射慢病毒即刻及注射慢病毒后10天檢測心

9、房有效不應期（atrial effective refractory period，AERP）及房顫誘發(fā)率。檢測區(qū)域為ARFPs周圍0.5 cm內(nèi)的心房肌。
　　3)分子生物學指標的檢測
　　分別取轉(zhuǎn)染組及對照組的ARFPs組織，對PGP9.5行qRT-PCR及免疫組化染色，對神經(jīng)生長因子，即生長蛋白相關(guān)43（growth-associated protein43，GAP43）行qRT-PCR，計算神經(jīng)密度，檢測PGP9.5

10、及GAP43 mRNAs的表達水平。
　　6、lncRNAs潛在的作用機制
　　1)Cis預測
　　對lncRNAs進行分類，通過cis機制尋找lncRNAs上下游300kb內(nèi)的mRNAs，qRT-PCR檢測lncRNAs及其上下游mRNAs的表達水平，明確其表達的相關(guān)性，結(jié)合文獻進行分析。
　　2)Trans預測
　　根據(jù)皮爾遜相關(guān)系數(shù)及P值，計算并選取前100個與lncRNAs共表達的mRNAs，進行G

11、O富集分析及KEGG通路分析，預測lncRNA的trans作用機制。通過文獻檢索明確與lncRNAs有關(guān)的分子信號通路，進一步通過qRT-PCR檢測通路中關(guān)鍵分子的表達水平進行驗證。
　　結(jié)果：
　　1、通過快速起搏成功建立房顫犬實驗模型，起搏組PGP9.5陽性神經(jīng)纖維的密度較對照組明顯增加。
　　2、通過二代高通量測序，共計獲得61616個推定的lncRNAs，根據(jù)一系列篩選條件，得出1164個候選lncRNAs，其

12、中，差異表達倍數(shù)＞2倍的有576個轉(zhuǎn)錄本，410個表達上調(diào)，166個表達下調(diào)，45個轉(zhuǎn)錄本被鑒定為全新的lncRNAs。隨機選取6個全新的lncRNAs，qRT-PCR證實測序結(jié)果真實、可靠。
　　3、GO富集分析及KEGG通路分析表明差異表達的基因主要參與了神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、細胞遷移及神經(jīng)退行性疾病等生物學過程;通過篩選差異性表達倍數(shù)＞2倍的轉(zhuǎn)錄本、預測靶基因的生物學功能并去除在骨骼肌組織中非特異性高表達的lncRNAs，篩選出2個

13、與神經(jīng)重構(gòu)相關(guān)的全新的表達下調(diào)的lncRNA-032546和lncRNA-026102。
　　4、免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染效率，qRT-PCR驗證沉默效率;心內(nèi)電生理結(jié)果表明，與對照組相比，AERP在轉(zhuǎn)染前及轉(zhuǎn)染即刻均無統(tǒng)計學差異，而轉(zhuǎn)染后10天，lncRNA-032546表達下調(diào)可明顯縮短AERP，相應的，短陣房速及房顫易誘發(fā);與之相比，下調(diào)lncRNA-026102明顯延長AERP，短陣房速及房顫不能誘發(fā)。
　　5、PGP9.5

14、免疫組化結(jié)果表明，相比于對照組，低表達lncRNA-032546組神經(jīng)密度明顯增加，低表達lncRNA-026102組神經(jīng)密度明顯減少;qRT-PCR結(jié)果提示，GAP43表達趨勢與免疫組化結(jié)果類似，下調(diào)lncRNA-032546表達后，PGP9.5mRNA表達水平明顯升高，而下調(diào)lncRNA-026102表達后，PGP9.5的mRNA表達水平無統(tǒng)計學差異。
　　6、lncRNA-032546和lncRNA-026102均為基因間l

15、ncRNAs，易通過cis機制調(diào)控鄰近靶基因的表達?；赾is預測，找出lncRNA-032546和lncRNA-026102上下游300 kb內(nèi)的mRNAs，qRT-PCR結(jié)果示下調(diào)lncRNA-032546和lncRNA-026102的表達分別上調(diào)CCND1-FGF19-FGF4-FGF3基因簇和SLC25A4的表達;通過文獻檢索明確差異表達的CCND1-FGF19-FGF4-FGF3基因簇和SLC25A4與神經(jīng)生長、發(fā)育密切相關(guān);

16、進一步通過生物信息學計算lncRNA與mRNA間的共表達系數(shù)，推測出lncRNA-032546和lncRNA-026102潛在的靶基因分別為CCND1-FGF19-FGF4-FGF3基因簇和SLC25A4。
　　結(jié)論：
　　1、在房顫/非房顫犬ARFP內(nèi)一系列l(wèi)ncRNAs存在顯著差異性表達，這些差異表達的lncRNAs參與了房顫心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)的發(fā)生;
　　2、我們發(fā)現(xiàn)了2個全新的lncRNA-032546和ln

17、cRNA-026102與房顫神經(jīng)重構(gòu)密切相關(guān)，并通過功能缺失實驗明確lncRNA-032546通過促進心臟內(nèi)在自主神經(jīng)的重構(gòu)易化房顫的發(fā)生，而lncRNA-026102則抑制心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)進而阻止房顫的發(fā)生;
　　3、我們預測了這2個lncRNAs的作用機制，即lncRNA-032546通過cis調(diào)控鄰近CCND1-FGF19-FGF4-FGF3基因簇并通過tr ans調(diào)控下游MAPK信號通路發(fā)揮作用;lncRNA-0261

18、02則通過cis調(diào)控鄰近靶基因SLC25A4，trans調(diào)控NF-kappa B通路發(fā)揮生物學功能。
　　創(chuàng)新性：
　　1、從lncRNAs的視角，觀察其表達水平變化對房顫心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)的影響;
　　2、探索lncRNAs通過cis調(diào)控鄰近靶基因及trans調(diào)控下游分子信號通路影響房顫心臟內(nèi)在自主神經(jīng)重構(gòu)的分子機制;
　　3、應用犬心臟脂肪墊在體轉(zhuǎn)染慢病毒介導的lncRNA沉默載體技術(shù)，研究lncRNAs對