神經(jīng)營養(yǎng)因子Artemin在胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、研究背景：胰腺癌的發(fā)病率逐年上升，早期診斷困難，進展迅速，預(yù)后極差。神經(jīng)侵襲是胰腺癌較為獨特的侵襲轉(zhuǎn)移方式，涉及腫瘤細胞和神經(jīng)之間的信號相互作用。膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)家族的四個成員及其相應(yīng)的受體在胰腺癌中都有不同程度的表達。其中神經(jīng)營養(yǎng)因子Artemin能夠促進多種不同神經(jīng)的生存，并具有軸突導(dǎo)向作用；Artemin還在胰腺癌、乳腺癌、

2、非小細胞肺癌和子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中存在異常表達，影響這些腫瘤的致瘤性和侵襲力。
　　 研究目的：從細胞水平、組織水平和動物水平研究Artemin在胰腺癌生長侵襲中的作用，探討靶向抑制Artemin蛋白表達對胰腺癌的潛在治療作用。
　　 研究方法：1.用Western blot法檢測11例胰腺癌及配對癌旁組織、6株胰腺癌細胞株的Artemin蛋白表達情況；用組織芯片免疫組織化學(xué)(IHC)方法檢測100例胰腺癌(60例導(dǎo)管

3、腺癌、40例腺鱗癌)的Artemin蛋白表達，分析其與各臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系；用生長相關(guān)蛋白(Growth associated protein43，GAP-43)IHC染色結(jié)合圖像分析計數(shù)胰腺間質(zhì)神經(jīng)纖維的數(shù)量和面積，分析Artemin蛋白表達與胰腺癌間質(zhì)神經(jīng)纖維肥大增生的關(guān)系。2.構(gòu)建Artemin真核表達質(zhì)粒和4種RNA干擾(RNAi)質(zhì)粒，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染PancI細胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Artemin過表達質(zhì)粒和RNAi質(zhì)粒的單克隆株

4、，并利用Western blot法和qRT-PCR法篩選出過表達和RNAi效率最高的細胞株；用MTT法繪制細胞生長曲線，用流式細胞儀檢測各組細胞周期和AnnexinV法檢測細胞凋亡，并通過克隆形成試驗、劃痕試驗、Transwell小室基質(zhì)膠侵襲實驗等比較各組細胞克隆形成、遷移、侵襲等生物學(xué)行為；收集Artemin過表達細胞和RNA干擾細胞的培養(yǎng)液上清，處理PC12細胞，觀察各組細胞生長和神經(jīng)元樣分化情況，比較各組癌細胞的神經(jīng)營養(yǎng)活性。3

5、.利用Artemin過表達和RNA干擾的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株，建立裸鼠原位移植瘤動物模型，觀察成瘤組織的人體和顯微鏡下特點，比較各組腫瘤大小、周圍器官侵犯、神經(jīng)侵犯、脈管癌栓及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況；GAP-43IHC染色結(jié)合圖像分析計數(shù)胰腺間質(zhì)神經(jīng)纖維的數(shù)量和面積，比較各組間質(zhì)神經(jīng)纖維肥大增生的情況。
　　 結(jié)果：1.胰腺癌組織中的Artemin表達水平顯著高于癌旁組織，6株胰腺癌細胞株中都有不同程度的Artemin表達；免疫組化檢測表明

6、Artemin在胰腺癌組織中的陽性率(71.0％)顯著高于癌旁組織(43.5％)，陽性定位于癌細胞、癌旁管狀復(fù)合物、間質(zhì)神經(jīng)纖維及動脈壁；Artemin在癌組織中的表達與胰腺癌的組織病理類型、性別年齡、部位、大小、分化程度和周圍器官侵犯等臨床病理學(xué)參數(shù)無關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)侵襲的發(fā)生有關(guān)；胰腺癌間質(zhì)中可見明顯的神經(jīng)病理學(xué)改變，包括神經(jīng)纖維肥大、增生及癌細胞侵犯神經(jīng)。Artemin陽性組神經(jīng)纖維的平均數(shù)量(49.72±5.177/cm

7、2)和面積(0.328±0.058mm2)均顯著高于Artemin陰性組神經(jīng)纖維平均數(shù)量(28.72±4.248/cm2)和面積(0.0857±0.025mm2)。2.在胰腺癌細胞中持續(xù)過表達Artemin增加了癌細胞克隆形成、細胞遷移、基質(zhì)膠侵襲等能力，細胞培養(yǎng)上清能夠誘導(dǎo)PC12細胞的神經(jīng)元樣分化；RNA干擾能夠顯著抑制癌細胞的克隆形成、遷移及侵襲力，細胞培養(yǎng)上清對PC12的誘導(dǎo)分化作用也不明顯；Artemin過表達或抑制對胰腺癌細

8、胞生長曲線、細胞周期和細胞凋亡均無明顯影響。3.Artemin過表達細胞與空載體對照相比，能夠增加裸鼠原位移植腫瘤的大小，在體內(nèi)能夠促進癌細胞向周圍器官侵襲，增加神經(jīng)侵襲及脈管侵襲的幾率，并促進癌旁神經(jīng)纖維增生；ArteminRNAi組細胞成瘤率降低、腫瘤體積更小，侵襲周圍器官的現(xiàn)象減少，神經(jīng)纖維數(shù)量減少，也未見脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及神經(jīng)侵犯現(xiàn)象。
　　 結(jié)論：1.胰腺癌組織表達的Artemin蛋白參與了胰腺癌間質(zhì)中神經(jīng)肥大與增

9、生等病理改變，并與癌細胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和神經(jīng)侵襲的發(fā)生有關(guān)。2.胰腺癌細胞表達的Artemin在體外能夠促進自身存活，增強癌細胞的遷移能力和侵襲力，并通過旁分泌作用產(chǎn)生了神經(jīng)營養(yǎng)屬性；ArteminRNAi能夠顯著抑制這些作用。3.在胰腺癌細胞中強制表達Artemin蛋白能夠增加原位移植瘤的體積，促進移植瘤向周圍器官、脈管及神經(jīng)侵襲，刺激間質(zhì)神經(jīng)纖維增生；靶向抑制Artemin表達對胰腺癌生長侵襲具有明顯的抑制作用，可能成為胰腺癌治療的潛