丹參酮ⅡA對(duì)DN血瘀證TGF-β1與NF-κB通路交互作用的研究.pdf

1、目的：⑴通過(guò)文獻(xiàn)綜述，了解糖尿病腎病的中西醫(yī)研究進(jìn)展，特別了解血瘀、炎癥因子及相關(guān)信號(hào)通路對(duì)糖尿病腎病影響及干預(yù)措施，為臨床研究及實(shí)驗(yàn)研究奠定理論依據(jù)。⑵通過(guò)臨床研究，了解血瘀證在DN中的比重及特點(diǎn)，明確血瘀對(duì)糖尿病腎病的影響;探討TGF-β1、NF-κ B與血瘀證的相關(guān)性;分析血瘀證患者使用活血化瘀藥的情況，為中醫(yī)防治DN治法的確立及活血化瘀中藥機(jī)理的研究提供依據(jù)。⑶通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討TGF-β1與NF-κ B通路與腎臟損害的關(guān)系，并給

2、予活血中藥成分丹參酮ⅡA進(jìn)行干預(yù)治療，對(duì)比觀察其對(duì)腎臟損害改善狀況及對(duì)TGF-β1與NF-κ B通路的影響。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，在體外高糖培養(yǎng)大鼠腎系膜細(xì)胞(HBZY-1)上，觀察高糖環(huán)境對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞增殖的影響，觀察并探討細(xì)胞內(nèi)TGF-β1與NF-κ B通路交通對(duì)話的機(jī)制，進(jìn)一步觀察活血中藥成分丹參酮Ⅱ A對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞的影響及其對(duì)TGF-β1與NF-κ B通路對(duì)話的干預(yù)作用，為活血化瘀中藥成分丹參酮ⅡA防治DN提供依據(jù)。
　　方

3、法：①對(duì)近年糖尿病腎病的中醫(yī)病名、病因病機(jī)、證候特征、中醫(yī)治療和現(xiàn)代流行病學(xué)、病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制、現(xiàn)代治療進(jìn)行系統(tǒng)的文獻(xiàn)綜述和梳理。②通過(guò)橫斷面調(diào)查分析DN患者血瘀證患者的臨床資料，了解血瘀證在DN中的比重及特點(diǎn)。前瞻性觀察血瘀證與非血瘀證糖尿病腎病患者在病程變化過(guò)程中腎臟損害程度的比較，明確血瘀對(duì)糖尿病腎病的影響。此外，觀察比較DN血瘀證患者與非血瘀證患者血清TGF-β1與NF-κ B濃度的差異，明確上述通路與血瘀證的相關(guān)性，并通過(guò)問(wèn)卷

4、調(diào)查分析血瘀證患者使用活血藥的情況。③在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，首先通過(guò)腹腔注射STZ并配合高能量飲食誘導(dǎo)大鼠DN模型，對(duì)該模型觀察動(dòng)物模型的表征觀察，使用全自動(dòng)生化儀器檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)及HE、PAS染色觀察腎臟病理改變，qRT-PCR、western blot方法檢測(cè)腎臟組織TGF-β與NF-κ B的表達(dá)，以探討TGF-β1與NF-κ B通路與腎臟損害的關(guān)系;對(duì)DN大鼠肌肉注射丹參酮Ⅱ A，使用上述實(shí)驗(yàn)方法對(duì)比觀察其對(duì)腎臟損害改善狀況及對(duì)TGF-β1

5、與NF-κB通路的影響。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，體外高糖培養(yǎng)大鼠腎系膜細(xì)胞(HBZY-1)，使用MTT技術(shù)觀察高糖環(huán)境對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞增殖的影響，使用siRNA技術(shù)探討細(xì)胞內(nèi)TGF-β1與NF-κB通路交通對(duì)話的機(jī)制，使用MTT計(jì)數(shù)、qRT-PCR觀察活血中藥成分丹參酮Ⅱ A對(duì)大鼠腎系膜細(xì)胞的影響及其對(duì)TGF-β1與NF-κ B通路對(duì)話的干預(yù)作用。
　　結(jié)果：⑴文獻(xiàn)研究結(jié)果顯示，糖尿病腎病是糖尿病的重要并發(fā)癥，具有發(fā)展迅速，預(yù)后不良等特點(diǎn)，

6、已經(jīng)成為影響人類(lèi)健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題，既往在病因病機(jī)探討中，圍繞稟賦不足、飲食失節(jié)、情志失調(diào)、勞欲過(guò)度等進(jìn)入探討，病機(jī)為正虛基礎(chǔ)上出現(xiàn)痰、瘀、濁、毒等病理產(chǎn)物，相互膠結(jié)，對(duì)人體產(chǎn)生持續(xù)損傷。血瘀是影響DN發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的一個(gè)關(guān)鍵因素。中醫(yī)在治療DN本虛的同時(shí)，往往兼顧治療患者的血瘀、水濕、痰濁、濕毒等?，F(xiàn)代研究提示，炎癥反應(yīng)貫穿于糖尿病腎病的全程，TGF-β1與NF-κB通路對(duì)話影響著疾病的進(jìn)展，但仍未有確切的治療方法和藥物。⑵臨床結(jié)果

7、表明：血瘀證占DN患者的74.2％，是主要的證型，血瘀證與糖尿病腎病的病程密切相關(guān)。DN的血瘀證在血小板、全血粘度（高切）、全血粘度（低切）(50s-1)及血沉方程K值明顯升高，提示血瘀是DN重要的病理產(chǎn)物；與非血瘀證患者相比，血瘀證患者在單位時(shí)間內(nèi)，24h尿蛋白定量及GFR呈現(xiàn)明顯的動(dòng)態(tài)變化，血清中TGF-β1、NF-κ B出現(xiàn)明顯的升高，提示血瘀是促進(jìn)DN進(jìn)展的重要因素，并與炎癥因子及相關(guān)通路活化有關(guān)；目前活血化瘀的用藥規(guī)律分析，使

8、用頻次依次為丹參、川芎、益母草、紅花、牡丹皮、大黃。反映了醫(yī)家多以和血類(lèi)及活血類(lèi)藥物為主，破血類(lèi)藥物較少。⑶在STZ誘導(dǎo)的DN大鼠模型中，出現(xiàn)精神萎靡、飲水量增多、尿量增多、形態(tài)消瘦等與DN臨床類(lèi)似癥狀，尿蛋白和空腹血糖明顯升高，給予丹參酮Ⅱ A干預(yù)后，上述癥狀得到改善，尿蛋白與空腹血糖下降，病理提示腎臟損害減輕，可能與下調(diào)TGF-β1與NF-κ B，上調(diào)Smad7有關(guān)。高糖誘導(dǎo)下大鼠腎系膜細(xì)胞隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞明顯增多，72hMTT

9、計(jì)數(shù)結(jié)果及較實(shí)驗(yàn)前具有明顯的差異。給予丹參酮ⅡA藥物進(jìn)行干預(yù)后，系膜細(xì)胞的增殖作用減弱，而且，高濃度的丹參酮ⅡA(100μ mol/L)較低濃度(10μ mol/L)的作用更為明顯。在高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞中加入siTGF-β1，系膜細(xì)胞增殖減少，NF-κ B的表達(dá)降低，而Smad7的表達(dá)上升;加入siP65（NF-κ B的重要分子），系膜細(xì)胞增殖減少，TGF-β1的表達(dá)降低，而Smad7的表達(dá)上升。
　　結(jié)論：①糖尿病腎病是糖尿病的

10、重要并發(fā)癥，血瘀是影響DN發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的一個(gè)關(guān)鍵因素。中醫(yī)在治療DN時(shí)，活血化瘀貫穿于始終。②血瘀證與糖尿病腎病的病程密切相關(guān)。血瘀不僅是DN重要的病理產(chǎn)物，也是促進(jìn)DN進(jìn)展的重要因素。血瘀并與TGF-β1、NF-κ B通路活化相關(guān)。在治療DN血瘀證中，多以和血類(lèi)及活血類(lèi)藥物為主，破血類(lèi)藥物較少使用。③丹參酮ⅡA可能通過(guò)下調(diào)TGF-β1與NF-κ B，上調(diào)Smad7改善DN腎臟損害。在大鼠腎臟系膜細(xì)胞中，存在著TGF-β1與NF-κ