丹參酮ⅡA對DN血瘀證TGF-β1與NF-κB通路交互作用的研究.pdf

1、目的：⑴通過文獻(xiàn)綜述，了解糖尿病腎病的中西醫(yī)研究進(jìn)展，特別了解血瘀、炎癥因子及相關(guān)信號通路對糖尿病腎病影響及干預(yù)措施，為臨床研究及實驗研究奠定理論依據(jù)。⑵通過臨床研究，了解血瘀證在DN中的比重及特點，明確血瘀對糖尿病腎病的影響;探討TGF-β1、NF-κ B與血瘀證的相關(guān)性;分析血瘀證患者使用活血化瘀藥的情況，為中醫(yī)防治DN治法的確立及活血化瘀中藥機(jī)理的研究提供依據(jù)。⑶通過動物實驗探討TGF-β1與NF-κ B通路與腎臟損害的關(guān)系，并給

2、予活血中藥成分丹參酮ⅡA進(jìn)行干預(yù)治療，對比觀察其對腎臟損害改善狀況及對TGF-β1與NF-κ B通路的影響。在細(xì)胞實驗中，在體外高糖培養(yǎng)大鼠腎系膜細(xì)胞(HBZY-1)上，觀察高糖環(huán)境對大鼠腎系膜細(xì)胞增殖的影響，觀察并探討細(xì)胞內(nèi)TGF-β1與NF-κ B通路交通對話的機(jī)制，進(jìn)一步觀察活血中藥成分丹參酮Ⅱ A對大鼠腎系膜細(xì)胞的影響及其對TGF-β1與NF-κ B通路對話的干預(yù)作用，為活血化瘀中藥成分丹參酮ⅡA防治DN提供依據(jù)。
　　方

3、法：①對近年糖尿病腎病的中醫(yī)病名、病因病機(jī)、證候特征、中醫(yī)治療和現(xiàn)代流行病學(xué)、病因?qū)W及發(fā)病機(jī)制、現(xiàn)代治療進(jìn)行系統(tǒng)的文獻(xiàn)綜述和梳理。②通過橫斷面調(diào)查分析DN患者血瘀證患者的臨床資料，了解血瘀證在DN中的比重及特點。前瞻性觀察血瘀證與非血瘀證糖尿病腎病患者在病程變化過程中腎臟損害程度的比較，明確血瘀對糖尿病腎病的影響。此外，觀察比較DN血瘀證患者與非血瘀證患者血清TGF-β1與NF-κ B濃度的差異，明確上述通路與血瘀證的相關(guān)性，并通過問卷

4、調(diào)查分析血瘀證患者使用活血藥的情況。③在動物實驗中，首先通過腹腔注射STZ并配合高能量飲食誘導(dǎo)大鼠DN模型，對該模型觀察動物模型的表征觀察，使用全自動生化儀器檢測相關(guān)指標(biāo)及HE、PAS染色觀察腎臟病理改變，qRT-PCR、western blot方法檢測腎臟組織TGF-β與NF-κ B的表達(dá)，以探討TGF-β1與NF-κ B通路與腎臟損害的關(guān)系;對DN大鼠肌肉注射丹參酮Ⅱ A，使用上述實驗方法對比觀察其對腎臟損害改善狀況及對TGF-β1

5、與NF-κB通路的影響。在細(xì)胞實驗中，體外高糖培養(yǎng)大鼠腎系膜細(xì)胞(HBZY-1)，使用MTT技術(shù)觀察高糖環(huán)境對大鼠腎系膜細(xì)胞增殖的影響，使用siRNA技術(shù)探討細(xì)胞內(nèi)TGF-β1與NF-κB通路交通對話的機(jī)制，使用MTT計數(shù)、qRT-PCR觀察活血中藥成分丹參酮Ⅱ A對大鼠腎系膜細(xì)胞的影響及其對TGF-β1與NF-κ B通路對話的干預(yù)作用。
　　結(jié)果：⑴文獻(xiàn)研究結(jié)果顯示，糖尿病腎病是糖尿病的重要并發(fā)癥，具有發(fā)展迅速，預(yù)后不良等特點，

6、已經(jīng)成為影響人類健康的公共衛(wèi)生問題，既往在病因病機(jī)探討中，圍繞稟賦不足、飲食失節(jié)、情志失調(diào)、勞欲過度等進(jìn)入探討，病機(jī)為正虛基礎(chǔ)上出現(xiàn)痰、瘀、濁、毒等病理產(chǎn)物，相互膠結(jié)，對人體產(chǎn)生持續(xù)損傷。血瘀是影響DN發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的一個關(guān)鍵因素。中醫(yī)在治療DN本虛的同時，往往兼顧治療患者的血瘀、水濕、痰濁、濕毒等?，F(xiàn)代研究提示，炎癥反應(yīng)貫穿于糖尿病腎病的全程，TGF-β1與NF-κB通路對話影響著疾病的進(jìn)展，但仍未有確切的治療方法和藥物。⑵臨床結(jié)果

7、表明：血瘀證占DN患者的74.2％，是主要的證型，血瘀證與糖尿病腎病的病程密切相關(guān)。DN的血瘀證在血小板、全血粘度（高切）、全血粘度（低切）(50s-1)及血沉方程K值明顯升高，提示血瘀是DN重要的病理產(chǎn)物；與非血瘀證患者相比，血瘀證患者在單位時間內(nèi)，24h尿蛋白定量及GFR呈現(xiàn)明顯的動態(tài)變化，血清中TGF-β1、NF-κ B出現(xiàn)明顯的升高，提示血瘀是促進(jìn)DN進(jìn)展的重要因素，并與炎癥因子及相關(guān)通路活化有關(guān)；目前活血化瘀的用藥規(guī)律分析，使

8、用頻次依次為丹參、川芎、益母草、紅花、牡丹皮、大黃。反映了醫(yī)家多以和血類及活血類藥物為主，破血類藥物較少。⑶在STZ誘導(dǎo)的DN大鼠模型中，出現(xiàn)精神萎靡、飲水量增多、尿量增多、形態(tài)消瘦等與DN臨床類似癥狀，尿蛋白和空腹血糖明顯升高，給予丹參酮Ⅱ A干預(yù)后，上述癥狀得到改善，尿蛋白與空腹血糖下降，病理提示腎臟損害減輕，可能與下調(diào)TGF-β1與NF-κ B，上調(diào)Smad7有關(guān)。高糖誘導(dǎo)下大鼠腎系膜細(xì)胞隨著時間的延長，細(xì)胞明顯增多，72hMTT

9、計數(shù)結(jié)果及較實驗前具有明顯的差異。給予丹參酮ⅡA藥物進(jìn)行干預(yù)后，系膜細(xì)胞的增殖作用減弱，而且，高濃度的丹參酮ⅡA(100μ mol/L)較低濃度(10μ mol/L)的作用更為明顯。在高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞中加入siTGF-β1，系膜細(xì)胞增殖減少，NF-κ B的表達(dá)降低，而Smad7的表達(dá)上升;加入siP65（NF-κ B的重要分子），系膜細(xì)胞增殖減少，TGF-β1的表達(dá)降低，而Smad7的表達(dá)上升。
　　結(jié)論：①糖尿病腎病是糖尿病的

10、重要并發(fā)癥，血瘀是影響DN發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸的一個關(guān)鍵因素。中醫(yī)在治療DN時，活血化瘀貫穿于始終。②血瘀證與糖尿病腎病的病程密切相關(guān)。血瘀不僅是DN重要的病理產(chǎn)物，也是促進(jìn)DN進(jìn)展的重要因素。血瘀并與TGF-β1、NF-κ B通路活化相關(guān)。在治療DN血瘀證中，多以和血類及活血類藥物為主，破血類藥物較少使用。③丹參酮ⅡA可能通過下調(diào)TGF-β1與NF-κ B，上調(diào)Smad7改善DN腎臟損害。在大鼠腎臟系膜細(xì)胞中，存在著TGF-β1與NF-κ