大菱鲆過敏原小清蛋白的制備及氧化對其IgE結(jié)合能力的影響.pdf

1、隨著魚類作為食品原料越來越廣泛的應(yīng)用到食品工業(yè)中，魚類過敏的發(fā)病率逐年提高，這一方面要求對食品中的魚類過敏原進(jìn)行嚴(yán)格的檢測，另一方面需要提高魚類過敏的診斷效果。世界很多國家都對食品中魚類過敏原進(jìn)行檢測，主要采用酶聯(lián)免疫的方法，由于魚類地域性差異及國際貿(mào)易日漸擴(kuò)大等問題，針對我國的對魚類過敏原特性的研究無論是對食品工業(yè)中魚類過敏原的檢測，還是對醫(yī)療領(lǐng)域魚類過敏的診斷都具有重要的意義。
　　本研究針對我國養(yǎng)殖和消費(fèi)量比較大的大菱鲆(S

2、cophthalmus maximus)，根據(jù)過敏原的已知特性對天然過敏原進(jìn)行提取和純化，由于抽提所得蛋白在冷凍儲藏期間其含量和活性均出現(xiàn)不同程度的降低，從而探討了過敏原在儲藏過程中的蛋白質(zhì)氧化對過敏原活性的影響。鑒于天然過敏原存在不穩(wěn)定、量小難以控制等問題，考慮利用基因工程技術(shù)對大菱鲆過敏原進(jìn)行分子克隆，制備重組的小清蛋白，來獲取穩(wěn)定的、安全的、重現(xiàn)性好的魚類過敏原。主要結(jié)果如下：
　　1.建立規(guī)范的大菱鲆過敏原抽提方法

3、　　大菱鲆過敏原小清蛋白是典型的酸性小分子蛋白質(zhì)，三個亞基之間會形成的聚集體，采用12種提取液對大菱鲆蛋白進(jìn)行抽提，通過對其IgE結(jié)合能力進(jìn)行檢測能夠獲得較好的蛋白質(zhì)抽提方法。加入DTT后，Tris，Glycine提取液抽提的蛋白質(zhì)的含量增加13.46％，IgG結(jié)合能力提高6.22%，并利用免疫印跡等進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示Tris、Glycine和DTT提取液抽提的16ku，36ku，41ku和46ku的蛋白能夠與3位過敏患者的血清發(fā)生強(qiáng)烈

4、的免疫反應(yīng)。和未加入DTT的同一種提取液相比，加入DTT的提取液獲得的蛋白的含量和活性較高。加入DTT的Tris，Glycine提取液獲得的蛋白濃度最高為4.51mg/mL；與過敏患者的血清結(jié)合能力比其他提取方法高。因此加入DTT的Tris，Glycine提取液可以用于大菱鲆過敏原的抽提。建立標(biāo)準(zhǔn)化的過敏原提取程序?qū)εR床診斷和治療是非常必要的，本研究旨在建立標(biāo)準(zhǔn)化的魚類過敏原的提取系統(tǒng)。
　　2.探討氧化作用對大菱鲆過敏原蛋白的影

5、響
　　為了探明蛋白質(zhì)儲藏過程中蛋白含量及活性的變化規(guī)律，本文以大菱鲆為研究對象，采用羥基自由基氧化體系對大菱鲆過敏原進(jìn)行不同程度的氧化，檢測其功能基團(tuán)的變化規(guī)律，并分別利用魚類過敏患者血清和兔抗大菱鲆小清蛋白多克隆抗體分析大菱鲆過敏原小清蛋白免疫功能的變化規(guī)律。結(jié)果表明：大菱鲆蛋白經(jīng)過5h氧化，27%的蛋白質(zhì)發(fā)生了沉淀。另外，氧化5h后上清液中和沉淀中的蛋白的羰基含量分別增加了9.7倍和2.0倍，上清液中和沉淀中蛋白的巰基含量分

6、別降低了13.5%和29.1%。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組中的12ku、26ku和41ku處蛋白的含量減少，然而沉淀中36ku左右的蛋白含量隨著氧化時間的增長而增加，可能是小分子蛋白聚集的結(jié)果。免疫印跡結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組蛋白與魚類過敏的患者血清之間的特異性反應(yīng)強(qiáng)度降低。ELISA結(jié)果表明經(jīng)過5h氧化處理后上清液中和沉淀中大菱鲆過敏原的活性分別降低了16.7%和31.5%。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明氧化改變了大菱鲆蛋白的理化性質(zhì)，并可能改變了大菱鲆蛋白的結(jié)構(gòu)

7、，進(jìn)而影響了大菱鲆過敏原蛋白的功能性質(zhì)。
　　3.重組蛋白的表達(dá)，鑒定及純化
　　利用分子克隆技術(shù)對大菱鲆小清蛋白進(jìn)行重組表達(dá)，并對重組蛋白的結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，進(jìn)而將其結(jié)構(gòu)和免疫活性與天然蛋白進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)通過SDS-PAGE分析誘導(dǎo)表達(dá)前后菌體蛋白組成，結(jié)果表明表達(dá)后的電泳圖譜比表達(dá)前多出一條帶（分子量約15ku），大腸桿菌成功表達(dá)出重組蛋白。在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)此蛋白可以與兔抗大菱鲆小清蛋白抗體發(fā)生免疫反應(yīng)；E