氨基甾體H42389對(duì)慢性髓性白血病細(xì)胞癌基因蛋白抑制作用的探討.pdf

1、目的:研究氨基甾體H42389對(duì)K562細(xì)胞系及CML細(xì)胞的增殖及分化作用，探討氨基甾體H42389對(duì)慢性髓性白血病細(xì)胞Ras癌基因相關(guān)蛋白的抑制作用。
　　方法:通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)、MTT實(shí)驗(yàn)觀察氨基甾體H42389對(duì)K562及CML細(xì)胞抑制增殖作用;采用Wright染色，聯(lián)苯胺染色，NBT染色和流式細(xì)胞術(shù)觀察K562和CML細(xì)胞功能變化，評(píng)價(jià)氨基甾體H42389對(duì)K562和CML細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用;通過(guò)熒光分光光度

2、計(jì)檢測(cè)氨基甾體H42389作用于K562和CML細(xì)胞30分鐘后胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化;通過(guò)Realtime-PCR檢測(cè)氨基甾體H42389對(duì)K562和CML細(xì)胞鈣通道蛋白mRNA表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1.氨基甾體H42389對(duì)K562細(xì)胞和CML細(xì)胞增殖的影響。將氨基甾體H42389按設(shè)定濃度加入到K562和CML細(xì)胞中，經(jīng)5天孵育，可以觀察到:隨著藥物濃度的加大，細(xì)胞增殖抑制程度加重，細(xì)胞MTT的A492值有明顯

3、的下降趨勢(shì)。
　　2.H42389對(duì)K562細(xì)胞和CML細(xì)胞分化的影響。K562和CML細(xì)胞培養(yǎng)5d后，Wright染色，光鏡下經(jīng)氨基甾體H42389處理后的細(xì)胞與對(duì)照組比可見細(xì)胞體積變大，核漿比例減少，表現(xiàn)一定程度的分化。K562細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白聯(lián)苯胺染色顯示，氨基甾體H42389作用5天后，聯(lián)苯胺染色的A492值隨著藥物濃度的升高而增高;CML細(xì)胞NBT染色A492值在一定藥物濃度(10-6mol/L～10-9mol/L)下呈現(xiàn)

4、出劑量依賴關(guān)系。流式細(xì)胞儀分析顯示，10-6mol/L的氨基甾體H42389作用于K562細(xì)胞4天后，細(xì)胞膜上CD71表面標(biāo)記表達(dá)陽(yáng)性率為79％;作用于CML細(xì)胞4天后，細(xì)胞膜上CD14表面標(biāo)記表達(dá)陽(yáng)性率為77％。
　　3.氨基甾體H42389抑制K562細(xì)胞和CML細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)其分化作用的機(jī)制研究
　　(1)氨基甾體H42389對(duì)K562和CML細(xì)胞內(nèi)游離[Ca2+]i的影響。10-6mol/L的H42389處理已用F

5、ura-2/AM負(fù)載過(guò)的K562和CML細(xì)胞，孵育后上機(jī)檢查結(jié)果顯示，K562細(xì)胞對(duì)照組的熒光值是176.30±1.62，處理組為114.88±1.73;CML細(xì)胞對(duì)照組的熒光值是184.03±1.52，處理組為112.90±0.91。表明經(jīng)藥物處理后的K562和CML細(xì)胞內(nèi)游離[Ca2+]i明顯低于對(duì)照組。
　　(2)Realtime-PCR檢測(cè)氨基甾體H42389作用后K562和CML細(xì)胞鈣通道蛋白mRNA的表達(dá)量變化。處理組

6、和對(duì)照組K56細(xì)胞鈣通道m(xù)RNA相對(duì)含量分別是2.45×10-3、5.59×10-3，結(jié)果說(shuō)明H42389作用K562細(xì)胞后可明顯下調(diào)鈣通道m(xù)RNA;處理組和對(duì)照組CML細(xì)胞鈣通道m(xù)RNA相對(duì)含量分別是2.24×10-3、5.74×10-3，結(jié)果說(shuō)明H42389作用CML細(xì)胞后可明顯下調(diào)鈣通道m(xù)RNA;
　　(3)Realtime-PCR檢測(cè)氨基甾體H42389作用后K562和CML細(xì)胞TC10 mRNA的表達(dá)量變化。處理組和對(duì)照

7、組K56細(xì)胞TC10 mRNA相對(duì)含量分別是2.17×10-2、6.65×10-2，結(jié)果說(shuō)明H42389作用K562細(xì)胞后可明顯下調(diào)TC10mRNA;處理組和對(duì)照組CML細(xì)胞鈣通道m(xù)RNA相對(duì)含量分別是2.22×10-3、6.71×10-2，結(jié)果說(shuō)明H42389作用CML細(xì)胞后可明顯下調(diào)TC10mRNA;
　　結(jié)論:
　　1.氨基甾體H42389能明顯抑制K562細(xì)胞以及CML細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，在一定藥物濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出濃度依

8、賴關(guān)系。
　　2.氨基甾體H42389能夠明顯誘導(dǎo)K562細(xì)胞向紅系分化成熟以及誘導(dǎo)CML細(xì)胞向單核巨噬系分化成熟。
　　3.氨基甾體H42389可使K562細(xì)胞以及CML細(xì)胞內(nèi)游離鈣含量顯著下降。
　　4.氨基甾體H42389具有促進(jìn)有效下調(diào)K562細(xì)胞以及CML細(xì)胞鈣通道蛋白mRNA表達(dá)的能力。
　　5.氨基甾體H42389具有有效下調(diào)K562細(xì)胞以及CML細(xì)胞Ras癌基因相關(guān)蛋白TC10 mRNA表達(dá)的能力