重癥肌無力患者胸腺組織GSTm3、KPNA5基因mRNA定量檢測及蛋白表達研究.pdf

1、目的：利用熒光定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR)方法定量分析KPNA5和GSTm3基因在重癥肌無力(MG)患者胸腺與正常胸腺組織中的mRNA表達水平，并利用免疫組織化學染色的方法對KPNA5蛋白在胸腺中的表達進行組織定位，探討兩基因與重癥肌無力發(fā)病的相關性，從而對今后MG的病因研究及進一步的生物治療奠定基礎。 方法： 實驗一：首先構建重組質粒pGEM-T-β-actin作為內參，提取重組質粒稀釋后行熒光定量聚合酶鏈反應(F

2、Q-PCR)擴增確定標準曲線，從臨床上20例重癥肌無力(MG)患者和10例先天性心臟病患者切除的胸腺組織中提取總RNA，逆轉錄合成目的基因KPNA5和GSTm3的cDNA，通過熒光定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR)擴增內參β-actin以及KPNA5和GSTm3基因，測定β-actin基因與KPNA5和GSTm3基因的CT值，分別以每例標本KPNA5基因與β-actin基因、GSTm3基因與β-actin基因CT值之比，作為該例標本目的基

3、因的相對表達量。 實驗二：30例標本經梯度溫度解凍至-30℃，做冰凍切片，用KPNA5抗體作為一抗，以PBS液代替一抗作陰性對照，按S-P試劑盒說明書進行免疫組化染色，在光學顯微鏡下對KPNA5蛋白在胸腺中的表達進行組織定位。 結果: 1.KPNA5基因在重癥肌無力患者和正常人胸腺組織中的mRNA表達水平分別為0.71±0.08和0.57±0.02，兩者之間的差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 2.

4、 GSTm3基因在重癥肌無力患者和正常人胸腺組織中的mRNA表達水平分別為0.67±0.10和0.58±0.05，兩者之間的差異有明顯的統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 3. KPNA5蛋白在胸腺中主要表達在胸腺小體，在40倍顯微鏡下，陽性染色的胸腺小體在重癥肌無力患者和正常人胸腺組織切片中計數(shù)分別為5.88±0.69和8.99±0.49，兩者之間的差異有明顯的統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 結論： 1.KPNA5和G