中樞神經系統(tǒng)內Sipl-Smad信號通路在髓鞘生成中的作用.pdf

1、一.研究目的:研究Smad相互作用蛋白-1(Sipl/Zfhx1b)對少突膠質細胞分化成熟的調節(jié)作用,以及發(fā)現(xiàn)Sip1的直接作用的下游基因,并探索Sip1/Zfhx1b促進少突膠質細胞分化成熟和啟動髓鞘生成作用的分子機制。
　　二.研究方法:1.Sip1/Zfhx1b在少突膠質細胞分化成熟中的作用:(1)免疫染色法測定Sip1在中樞神經系統(tǒng)內少突膠質細胞豐富區(qū)域的表達情況;(2)原位雜交技術確定Sip1在脊髓中的發(fā)育情況;(3)建

2、立少突膠質細胞內Sip1特異性敲除模型,評價Sip1敲除后小鼠的小鼠表型和生存的影響;(4)Sip1敲除小鼠模型中,免疫染色法和原位雜交技術評價與少突膠質細胞分化成熟的相關標記物的變化情況;(5)電鏡下觀察Sip1敲除小鼠的髓鞘生成的變化情況;(6)免疫染色法評價體外敲除Sip1基因對少突膠質細胞的影響;(7)Sip1敲除小鼠模型中,原位雜交技術確定OPC的增殖能力的改變情況。2. Sipl/Zfhx1b調控少突膠質細胞分化成熟和啟動髓

3、鞘生成作用的分子機制研究:2.1 Sipl/Zfhx1b調控少突膠質細胞分化成熟相關通路的分子機制研究(1)熒光素酶報告基因法確定Sip1對少突膠質細胞分化成熟相關的調控因子和髓鞘基因的改變情況;(2)免疫共沉淀法和Western-blotting法檢測Smad通路蛋白的表達情況;(3)免疫熒光法測定磷酸化Smad1的在體內的變化;(4)免疫熒光技術檢測在OPC內過表達Sip1后OPC的分化成熟情況;(5)實時熒光定量PCR法檢測細胞內

4、過表達Sip1后與少突膠質細胞分化成熟相關通路的改變情況;(6)原位雜交技術,免疫染色法和實時定量PCR檢測動物體內髓鞘相關基因或蛋白的表達情況;(7)染色質免疫共沉淀檢測Sip1與少突膠質細胞發(fā)育相關的基因啟動子的結合能力。2.2 Sip1/Zfhx1b調控少突膠質細胞分化成熟時直接下游基因的鑒別(1) Gene-chip microarray法鑒別Sip1直接作用的下游基因;(2)原位雜交技術觀察Smad7在老鼠脊髓發(fā)育過程的表達情

5、況;(3)免疫染色法觀察Smad7在脊髓少突膠質細胞內的表達情況;(4)雞胚神經管內過表達Smad7對少突膠質細胞標記物的影響;(5)免疫熒光法和實時熒光定量PCR法檢測Smad7和Sip1在OPC和OLs兩個階段的表達情況;(6)染色質免疫共沉淀法測定Sip1結合Smad7啟動子的能力;(7)實時熒光定量PCR測定Sip1過表達后對Smad7的影響;(8)免疫熒光法測定Smad7過表達后對Sip1缺失的少突膠質細胞分化的影響;(9)

6、Western blot法測定Smad7過表達后對BMP信號通路和其他通路的影響;(10)Smad7敲除小鼠模型中,原位雜交技術評價與少突膠質細胞分化成熟的相關標記物的變化情況。
　　三.研究結果:1. Sipl/Zfhxlb敲除引起少突膠質細胞分化成熟和中樞神經系統(tǒng)髓鞘生成的缺陷(1)Sip1表達在中樞神經系統(tǒng)內腦的皮層和白質區(qū)域以及脊髓的白質區(qū)較多,并且在成熟的CC1+的OLs內表達較強,而在PDGFRα+的OPC內表達相對較

7、弱；(2)胚胎期E14.5～16.5時,Sip1在脊髓的白質區(qū)域沒有表達,而在生后當天(P0)在脊髓的腹側出現(xiàn),隨著時間增加表達不斷增多;(3)少突膠質細胞內Sip1特異性敲除小鼠(Sip1cKO)出現(xiàn)震顫,發(fā)抖,共濟失調性步態(tài)行走等表型,并且在兩周左右出現(xiàn)死亡;(4) Sip1cKO小鼠中,成熟髓鞘蛋白髓鞘堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質蛋白(PLP1)在脊髄和大腦白質區(qū)域明顯下降或完全消失,CC1蛋白表達明顯下降;(5) P14 Sip

8、1cKO小鼠視神經和脊髓內幾乎沒有髓鞘的生成;(6) Cre-GFP病毒感染的Sipc/c細胞分化能力明顯減弱,細胞的分化被阻斷在OPC階段;(7)P14的Sip1cKO小鼠和野生型小鼠PDGFRα+的細胞沒有明顯差異,OPC增殖能力也未受到影響。2. Sip1/Zfhx1b通過BMP/Smad通路調控少突膠質細胞分化成熟和啟動髓鞘生成2.1 Sip1/Zfhx1b通過和p-Smad1相互作用調控少突膠質細胞分化成熟:(1)Sipl和受

9、體激活的Smad1相互作用逆轉BMP通路對MBP啟動子的抑制作用,也可改變BMP通路對Id2,Id4和Hes1的活化作用;(2)Co-IP結果表明Sip1只能同磷酸化的Smad1相互結合;在少突膠質細胞原代培養(yǎng)中,Sip1在OLs蛋白表達增加,并且通過p300介導同p-Smad1相互作用;(3)pSmad1的表達在P14Sip1cKO和野生型小鼠脊髓腹側部中沒有明顯變化;(4)OPC內過表達Sipl后,Rip+成熟前少突膠質細胞細胞量明

10、顯增加,PDGFRa+的OPC細胞量顯著減少;(5)在HCN細胞內電轉過表達Sip1,24h后Sip1mRNA水平升高,同少突膠質細胞形成正相關的一些因子mRNA水平也明顯增加;而在Oli-neu細胞中過表達Sip1可顯著降低抑制少突膠質細胞分化因子的mRNA水平;(6)P14的Sip1cKO小鼠的脊髓內MRF,Sox10和Cgt表達水平明顯下降;(7)Sip1能同MRF和Sox10的啟動子區(qū)域結合,而且Sip1能同Id2,Id4和He

11、sl的啟動子區(qū)域結合。結合同通過調節(jié)染色質的甲基化而促進少突膠質細胞的分化。2.2 Sip1/Zfhx1b通過誘導Smad7的增加調控少突膠質細胞分化成熟:(1)Gene-chip microarray法鑒別出多種基因都受到Sipl調控,在其中我們發(fā)現(xiàn)了Smad7可能直接被Sipl調控;(2)小鼠脊髓發(fā)育過程中,PO的小鼠脊髓內可檢測到Smad7信號,并且主要集中在白質區(qū)腹側部,隨著時間的增加在P14達到峰值,隨后其表達又下降;(3)脊

12、髓內,Smad7在OPC和成熟少突膠質細胞的兩個階段都有表達;(4)雞胚神經管內過表達Smad7能促進PDGFRα+和Sox10+的異位表達;(5)Smad7和Sip1在OPC和OLs兩個階段都有表達,但是兩者的蛋白水平和mRNA水平都在OLs內表達增加;(6)OLs內Sipl和Smad7啟動子的不同區(qū)域結合能力很強,而OPC內Sipl完全沒有結合到Smad7的啟動子區(qū)域;(7)HCN內過表達Sipl,Smad7mRNA水平明顯增加;(

13、8)Smad7過表達可明顯改善Sip1缺失的少突膠質細胞分化缺陷;(9)Smad7和Smurf1兩者共表達組,BMPR1a, p-Smad1和β-catenin蛋白水平明顯降低;(10)Smad7敲除小鼠模型中,Mbp和Plpl mRNA明顯降低,但PDGFRa+mRNA水平沒有明顯改變。
　　四.結論:(1)體內外敲除Sip1都能顯著抑制少突膠質細胞的分化成熟。(2)體內敲除Sip1可引起小鼠的髓鞘生成障礙。(3)Sip1與Sm