碳青霉烯類耐藥斯坦利沙門菌的發(fā)現(xiàn)及其耐藥機(jī)制研究.pdf

1、抗生素?zé)o疑是20世紀(jì)最偉大的發(fā)現(xiàn)之一，挽救了無數(shù)患者的生命。但是由于目前臨床醫(yī)療及其他領(lǐng)域抗菌藥的大量應(yīng)用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性急劇增加，多重耐藥細(xì)菌層出不窮，給臨床治療帶來巨大的挑戰(zhàn)。細(xì)菌產(chǎn)水解抗菌藥的酶是主要耐藥機(jī)制之一。腸桿菌科細(xì)菌作為臨床上主要的病原菌，產(chǎn)ESBLs及AmpC酶是耐β-內(nèi)酰胺類抗生素的主要機(jī)制，其中碳青霉烯類抗生素對ESBLs及AmpC酶穩(wěn)定，是治療這些多重耐藥菌感染的主要藥物。
　　近幾年，碳青霉烯類耐藥腸桿菌

2、科細(xì)菌的不斷出現(xiàn)，對全球人類健康造成嚴(yán)重威脅。只有極少數(shù)的抗生素如多粘菌素、替加環(huán)素、磷霉素等可能對碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌有效。2009年報(bào)道發(fā)現(xiàn)編碼一種新碳青霉烯酶的基因blaNDM-1,由于攜帶該基因的細(xì)菌耐藥性強(qiáng)，呈洲際傳播，被稱為“超級細(xì)菌”，令全世界為之恐慌。深入研究NDM-1，掌握其特點(diǎn)，對于治療及控制傳播有重要意義。
　　沙門菌?。╯almonellosis）是一種重要的人畜共患病，沙門菌是其病原菌。沙門菌作為最

3、重要的食源性傳染病病原菌之一，常導(dǎo)致爆發(fā)流行。自1885年Salmon和Smith分離到豬霍亂沙門菌以來，對沙門菌的研究歷史已有100多年。目前，已發(fā)現(xiàn)的沙門菌的血清型有2000多種。抗生素的應(yīng)用對控制和預(yù)防沙門菌病發(fā)揮了巨大的作用，然而隨著抗菌藥的濫用和不當(dāng)使用，沙門菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，表現(xiàn)為多重耐藥甚至碳青霉烯類耐藥。2011年美國科學(xué)家在一位從印度轉(zhuǎn)送至美國就醫(yī)的患者的直腸拭子中分離到產(chǎn)NDM-1亞胺培南耐藥沙門菌;2012年9月

4、法國微生物工作者再一次在一位從印度轉(zhuǎn)送至法國就醫(yī)的患者尿液中分離到產(chǎn)NDM-1沙門菌，此兩株沙門菌均在細(xì)菌監(jiān)測過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)并未造成感染。雖然目前碳青霉烯類耐藥沙門菌鮮有報(bào)道，但是由于沙門菌傳染性強(qiáng)，一旦耐藥細(xì)菌及耐藥基因的傳播，將嚴(yán)重危害人類的健康，因此沙門菌的耐藥性上升更加受到關(guān)注。課題組首次從一位高熱伴腹瀉患兒的糞便中培養(yǎng)到碳青霉烯類耐藥沙門菌。本課題對碳青霉烯類耐藥沙門菌感染患者的臨床資料進(jìn)行分析，對耐藥質(zhì)粒全序列進(jìn)行測定，進(jìn)

5、一步研究耐藥機(jī)制及耐藥傳播特點(diǎn)，為耐藥菌感染的防治提供依據(jù)。
　　第一部分碳青霉烯類耐藥斯坦利沙門菌的發(fā)現(xiàn)
　　患兒因發(fā)熱6天伴粘液血便3天入院，入院前先后予哌拉西林他/唑巴坦及頭孢西丁治療4天未見明顯好轉(zhuǎn)，最高體溫39℃～40℃，入院后大便培養(yǎng)到沙門菌，血清凝集試驗(yàn)確定為斯坦利沙門菌，該菌表現(xiàn)為對β-內(nèi)酰胺類抗生素包括碳青霉烯類和酶抑制劑復(fù)合制劑耐藥，對米諾環(huán)素、氯霉素、磷霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星及阿奇霉素等敏感?；純喝?/p>

6、院后應(yīng)用阿奇霉素治療，住院5天后康復(fù)出院。在出院3個(gè)月后的隨訪中，患兒及密切接觸家屬的大便未培養(yǎng)到碳青霉烯類耐藥沙門菌。對患兒的居住地及喂養(yǎng)史進(jìn)行調(diào)查未發(fā)現(xiàn)特殊情況，經(jīng)初步調(diào)查，病例為散發(fā)。應(yīng)用多位點(diǎn)基因序列分型(MLST)方法確定該菌為ST29。未發(fā)現(xiàn)該菌與印度大陸有直接聯(lián)系。
　　第二部分碳青霉烯類耐藥斯坦利沙門菌的耐藥機(jī)制及耐藥性傳播特點(diǎn)
　　碳青霉烯類耐藥沙門菌金屬β-內(nèi)酰胺酶檢測為陽性，改良Hodge試驗(yàn)表現(xiàn)弱陽性

7、，經(jīng)PCR擴(kuò)增及序列測定，證實(shí)該菌攜帶了耐藥基因blaNDM-1。通過接合試驗(yàn)，碳青霉烯類耐藥性成功地傳遞給大腸埃希菌C600及肺炎克雷伯菌13883，接合效率為10-7～10-4/15分鐘，接合子耐藥表型與斯坦利沙門菌臨床株一致，接合子與臨床株（供體菌）的質(zhì)粒大小相同，該質(zhì)粒命名為pHS36-NDM，質(zhì)粒分型為IncA/C。
　　以質(zhì)粒V517、R1及R27為參照，初步測定該質(zhì)粒DNA序列全長約140 kb。為了解NDM-1及其

8、攜帶質(zhì)粒的穩(wěn)定性，將攜帶blaNDM-1的細(xì)菌分別在無抗性的LB液體培養(yǎng)基中傳代14天，培養(yǎng)溫度為37℃，每天隨機(jī)各測定20個(gè)克隆對碳青霉烯類的敏感性。碳青霉烯類耐藥斯坦利沙門菌在無抗性傳代的第3天及第9天分離到3株blaNDM-1陰性的碳青霉烯類敏感斯坦利沙門菌，未抽提到pHS36-NDM質(zhì)粒，考慮為質(zhì)粒丟失。丟失pHS36-NDM質(zhì)粒的沙門菌恢復(fù)對β-內(nèi)酰胺類抗生素的敏感性。接合子在傳代14天未分離到丟失碳青霉烯類耐藥性的菌株。生長

9、曲線測定顯示，攜帶pHS36-NDM質(zhì)粒的菌株與丟失該質(zhì)粒的菌株無明顯差別。
　　第三部分 pHS36-NDM質(zhì)粒序列研究及NDM-1生物信息學(xué)分析
　　使用新一代高通量測序技術(shù)對pHS36-NDM質(zhì)粒序列進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，該質(zhì)粒全長為138，001bp，平均G+C mol％值為約52％。經(jīng)NCBI網(wǎng)站ORF Finder軟件分析確定其編碼序列即ORF為763個(gè)，通過與公共數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)可以識(shí)別功能的ORF有170個(gè)。發(fā)

10、現(xiàn)質(zhì)粒pHS36-NDM結(jié)構(gòu)特點(diǎn):1.存在編碼Ⅳ型接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)蛋白基因traA，traB，traC，traD，traE，traF，traG, traH, traI,traK，traL，traW，traU，traN，traV等，表明該質(zhì)粒具有水平轉(zhuǎn)移能力;2.具有StbA基因編碼質(zhì)粒穩(wěn)定蛋白，提示與pHS36-NDM質(zhì)粒穩(wěn)定性有關(guān);3.具有多種與基因轉(zhuǎn)移相關(guān)的插入序列、整合酶、轉(zhuǎn)座子基因結(jié)構(gòu)包括ISEcp1、IS4321、Tn1696、i

11、ntl1、ISKpn14、ISAb125和ISCR27，表明質(zhì)粒具有強(qiáng)大的可塑性;4.攜帶耐藥基因sul1，blaCMY-6，blaNDM-1，介導(dǎo)的耐藥性與藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果相符。此外，該質(zhì)粒序列中存在與質(zhì)粒復(fù)制和轉(zhuǎn)移調(diào)控以及蛋白質(zhì)表達(dá)等有關(guān)的重復(fù)序列，推測這些序列對調(diào)控質(zhì)粒的拷貝數(shù)有一定意義。
　　pHS36-NDM全序列及blaNDM-1基因兩端結(jié)構(gòu)與分離自意大利的大腸埃希菌、分離自加拿大的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌攜帶質(zhì)粒上

12、blaNDM-1基因的周邊結(jié)構(gòu)高度一致性，但沒有明確的證據(jù)表明細(xì)菌這些國家間傳播;與印度分離的肺炎克雷伯菌的blaNDM-1基因兩端結(jié)構(gòu)相似度較低。推測在環(huán)境中存在該核酸片段，在物種進(jìn)化及抗生素壓力選擇下，細(xì)菌可整合該片段以適應(yīng)環(huán)境的變化。
　　應(yīng)用生物信息學(xué)分析工具得出NDM-1蛋白的理化性質(zhì)，軟件推測NDM-1的分子式為C1256H1973N353O377814,由269個(gè)氨基酸組成，相對分子量28KDa，等電點(diǎn)為5.88，疏

13、水性GRAVY的值為0.010。NDM-1結(jié)構(gòu)域氨基酸位置:74～250，屬于Family Lactamase_B(PF00753)蛋白質(zhì)家族。氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)NDM-1與其他碳青霉烯酶的同源性不高，同源性最高為VIM，約32％。
　　結(jié)論
　　1.首次在腸道感染患兒糞便中分離到攜帶blaNDM-1的碳青霉烯類耐藥斯坦利沙門菌，該菌株的MLST分型為ST29。該菌對為β-內(nèi)酰胺類抗生素包括β-內(nèi)酰胺酶抑制劑合劑和碳青

14、霉烯類耐藥，但對阿奇霉素、環(huán)丙沙星及米諾環(huán)素敏感;由于產(chǎn)NDM-1沙門菌改良Hodge試驗(yàn)弱陽性，臨床檢測時(shí)容易漏檢。
　　2.blaNDM-1基因位于可轉(zhuǎn)移的IncA/C型pHS36-NDM質(zhì)粒上，耐藥質(zhì)粒以高接合頻率轉(zhuǎn)移至大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。IncA/C型質(zhì)粒是攜帶blaNDM-1基因的重要載體。pHS36-NDM質(zhì)粒在菌株傳代中穩(wěn)定、不易丟失，這一特性是其加速耐藥性傳播的重要基礎(chǔ)。
　　3.pHS36-NDM質(zhì)粒