CTR1、ATP7A、ATP7B在大鼠順鉑耳毒性中的作用與硫酸銅的干預(yù)研究.pdf

1、第一部分順鉑不同給藥方法對大鼠耳蝸功能和形態(tài)影響
　　 目的:
　　 研究順鉑的不同給藥方法對大鼠耳蝸的功能和形態(tài)影響，探討建立順鉑耳聾動物模型的有效方法。
　　 方法:
　　 Wistar雄性大鼠隨機分為三組，組Ⅰ為生理鹽水圓窗用藥組(6只)，組Ⅱ為順鉑圓窗用藥組（6只），組Ⅲ為順鉑腹腔注射組(6只)。采用聽性腦干反應(yīng)、耳蝸中軸石蠟切片HE染色及基底膜蘇木素染色毛細胞計數(shù)技術(shù)來評估大鼠的功能和形態(tài)改變情

2、況。
　　 結(jié)果:
　　 1.聽性腦干反應(yīng)檢測:組Ⅰ動物在用藥前后聽閾提高了1.66±4.08dB SPL，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，組Ⅱ與組Ⅲ動物用藥前后聽閾分別提高56.67±17.51dB SPL、41.67±14.72dB SPL，差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。組Ⅱ、組Ⅲ分別與組Ⅰ比較，差異均有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。組Ⅱ與組Ⅲ比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 2

3、.耳蝸中軸切片HE染色:組Ⅰ動物Corti's器、螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋形態(tài)正常。組Ⅱ與組Ⅲ動物Corti's器皺縮，外毛細胞斷裂甚至缺失;螺旋神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)目減少，細胞核變小;神經(jīng)纖維排列紊亂;血管紋結(jié)構(gòu)紊亂，細胞水腫樣變。
　　 3.耳蝸基底膜鋪片及毛細胞計數(shù):組Ⅰ毛細胞排列緊密、染色均勻、未見到內(nèi)、外毛細胞有明顯缺失。組Ⅱ外毛細胞缺失明顯，尤以第一排、第二排明顯，內(nèi)毛細胞排列整齊，僅見少量缺失。組Ⅲ以外毛細胞缺失為主，內(nèi)毛細胞基

4、本保持完好。毛細胞計數(shù)顯示組Ⅰ內(nèi)、外毛細胞平均缺失率低，各回的外毛細胞平均缺失率與組Ⅱ、組Ⅲ比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。組Ⅱ與組Ⅲ的毛細胞缺失以底回的外毛細胞為主，中回次之，頂回?zé)o明顯的外毛細胞缺失，比較組Ⅱ與組Ⅲ各回外毛細胞的平均缺失率，差異不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。各組的內(nèi)毛細胞缺失率均較低。
　　 結(jié)論:
　　 1.開放聽泡從圓窗用藥的手術(shù)操作不會引起內(nèi)耳的形態(tài)學(xué)改變和功能的變化。

5、　　 2.采用順鉑(1mg/ml)圓窗給藥的方法能夠成功建立順鉑耳毒性的大鼠模型，有操作方法簡單，致死率低，動物狀態(tài)好等優(yōu)點。
　　 第二部分銅離子轉(zhuǎn)運蛋白家族CTR1、ATP7A、ATP7B在大鼠順鉑耳毒性中的作用
　　 目的:
　　 了解銅離子轉(zhuǎn)運蛋白家族中CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白在大鼠順鉑耳毒性中的空間分布特點和表達量的改變;硫酸銅、順鉑圓窗給藥后對CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白表達的影

6、響，為探討順鉑耳毒性的防治提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 Wistar雄性大鼠隨機分為4組，組Ⅰ正常對照組（非處理組，6只），組Ⅱ硫酸銅(0.02mg/kg)圓窗浸潤組（6只），組Ⅲ硫酸銅(0.04mg/kg)圓窗浸潤組（6只），組Ⅳ順鉑(1 mg/ml)圓窗浸潤組（6只）。采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，對各組近中軸位耳蝸石蠟切片行CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白的免疫組織化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察耳蝸組織中的表達情況。

7、提取各組耳蝸組織總蛋白，應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測各組CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白表達水平。提取耳蝸組織的總RNA，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測各組CTR1mRNA、ATP7AmRNA、ATP7BmRNA的表達水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.免疫組化檢測CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白的表達:正常對照組和實驗各組的耳蝸各回Corti's器、螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋的細胞質(zhì)和細胞膜上均檢測到了CTR1、ATP7

8、A、ATP7B的表達。IPP6.0軟件分析其平均光密度值顯示CTR1的平均光密度值呈現(xiàn)降低趨勢，而ATP7A和ATP7B的平均光密度值呈現(xiàn)增高趨勢。
　　 2.Western-blot技術(shù)檢測CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白的表達: CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白在各組的耳蝸組織均有明顯的表達，采用bandscan6.0對各個條帶進行光密度分析，結(jié)果用目的條帶與beta-actin條帶的光密度比值來表示。CTR1蛋白的

9、光密度分析顯示各組分別為0.532±0.031、0.394±0.024、0.234±0.030和0.191±0.015呈下降的趨勢，組與組之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05); ATP7A蛋白的光密度值分別為0.149±0.012、0.274±0.026、0.420±0.030和0.515±0.021，呈上升的趨勢，組與組之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。ATP7B蛋白的光密度值分別為0.146±0.013、0.273±

10、0.027、0.423±0.027和0.513±0.053，呈上升的趨勢，組與組之間比較，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.RT-PCR檢測CTR1mRNA、ATP7A mRNA、ATP7B mRNA的表達:CTR1mRNA、ATP7A mRNA、ATP7BmRNA在各組的耳蝸組織均有明顯的表達，采用bandscan6.0對各個條帶進行光密度分析，結(jié)果用目的條帶與beta-actin條帶的光密度比值來表示。CTR1 mR

11、NA的光密度分析顯示各組分別為0.508±0.035、0.391±0.022、0.240±0.023和0.186±0.021，呈下降的趨勢，組與組之間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05); ATP7A mRNA光密度分析顯示分別為0.148±0.012、0.262±0.025、0.423±0.029和0.510±0.056，呈上升的趨勢，組與組之間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。ATP7BmRNA的光密度分析顯示0.144

12、±0.013、0.267±0.023、0.416±0.019和0.509±0.059呈上升的趨勢，組與組之間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白在各組的耳蝸Corti's器、螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋均有明顯的表達，提示CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白參與了順鉑和銅離子在內(nèi)耳的轉(zhuǎn)運。
　　 2.銅離子圓窗給藥能夠促進CTR1蛋白表達的下降和ATP7A

13、和ATP7B蛋白的表達的升高，提示CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白在內(nèi)耳細胞中發(fā)揮維持銅離子平衡的作用。
　　 3.圓窗給藥建立的大鼠耳毒性模型中CTR1蛋白表達下降和ATP7A、ATP7B蛋白表達升高，提示內(nèi)耳細胞可能通過調(diào)節(jié)CTR1、ATP7A、ATP7B蛋白的表達量來減少順鉑的吸收，這可能是內(nèi)耳細胞拮抗順鉑耳毒性的一種自身反饋機制。
　　 第三部分硫酸銅圓窗給藥對大鼠順鉑耳毒性的保護作用
　　 目的:<

14、br>　　 探討硫酸銅圓窗給藥對順鉑耳毒性的保護作用，為硫酸銅局部給藥治療順鉑耳毒性提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 Wistar雄性大鼠隨機分為三組，組Ⅰ生理鹽水圓窗浸潤30min+順鉑腹腔給藥20mg/kg（6只），組Ⅱ硫酸銅圓窗浸潤30min+順鉑腹腔給藥20mg/kg（6只），組Ⅲ硫酸銅圓窗浸潤4h+順鉑腹腔給藥20mg/kg（6只）。采用聽性腦干反應(yīng)、耳蝸中軸石蠟切片HE染色及基底膜蘇木素染色毛細胞計數(shù)技術(shù)

15、評估硫酸銅對順鉑耳毒性的保護作用。
　　 結(jié)果:
　　 1.聽性腦干反應(yīng)檢測:組Ⅰ、組Ⅱ和組Ⅲ大鼠在順鉑腹腔給藥和耳部干預(yù)之后聽力閾值分別升高53.33±15.06、15.00±5.48和18.33±7.53。組Ⅰ與組Ⅱ、組Ⅰ與組Ⅲ之間聽閾的改變有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)，組Ⅱ與組Ⅲ之間聽閾的改變無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 2.耳蝸中軸切片HE染色:組Ⅰ耳蝸毛細胞缺失明顯，結(jié)構(gòu)欠清晰，蓋膜

16、消失;螺旋神經(jīng)節(jié)細胞水腫，細胞核變小，數(shù)目減少;神經(jīng)纖維排列紊亂;血管紋結(jié)構(gòu)紊亂。組Ⅱ耳蝸毛細胞結(jié)構(gòu)清晰，蓋膜完整;螺旋神經(jīng)節(jié)細胞排列緊密，細胞核大，細胞質(zhì)少;神經(jīng)纖維呈條索狀，分布均勻，排列整齊;血管紋形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰。組Ⅲ耳蝸毛細胞未見明顯的損害;螺旋神經(jīng)節(jié)細胞排列整齊，細胞核染色均勻;神經(jīng)纖維呈條索狀，分布均勻，排列整齊;血管紋形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰。
　　 3.耳蝸基底膜鋪片及毛細胞計數(shù)顯示:組Ⅰ外毛細胞缺失明顯、排列紊亂

17、。內(nèi)毛細胞完整，損害不明顯。組Ⅱ外毛細胞染色均勻、僅見少數(shù)細胞缺失;內(nèi)毛細胞排列整齊、染色均勻。組Ⅲ外毛細胞染色均勻、排列整齊、少數(shù)外毛細胞缺失;內(nèi)毛細胞排列整齊、染色均勻。毛細胞計數(shù)結(jié)果顯示，組Ⅰ外毛細胞損害較重，以底回為主，中回次之，頂回缺失較少，比較組Ⅰ與組Ⅱ，組Ⅰ與組Ⅲ的各回外毛細胞平均缺失率，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。比較組Ⅱ與組Ⅲ的各回的平均毛細胞缺失率，差異無明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。各組內(nèi)毛細胞的缺失率均較低。