匯利心康及白藜蘆醇對野百合堿誘導的肺動脈高壓及右心室重構(gòu)的影響及機制研究.pdf

1、肺動脈高壓是進行性和致命性疾病，系多種原因引起的肺循環(huán)壓力高于正常的病癥，可繼發(fā)右心室重構(gòu)、右心衰竭，故防治肺動脈高壓及右心室重構(gòu)具有重要的臨床意義?，F(xiàn)可用的降肺動脈高壓藥物不僅數(shù)量少、療效有限、且因缺乏針對性，因而存在諸多不良反應。目前對右心室重構(gòu)的研究相當有限，且臨床無針對性抗右心室重構(gòu)藥物，因此，尋找抗肺動脈高壓和/或抗右心室重構(gòu)新藥十分必要。肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)異常增殖，導致遠端肺動脈腔狹窄，甚至阻塞，造成肺血管阻力

2、增加，是肺動脈高壓病理生理機制的重要特點。因此，抑制或逆轉(zhuǎn)肺動脈平滑肌增殖，改善遠端肺動脈重構(gòu)，是預防和治療肺動脈高壓的關鍵措施之一。右心室重構(gòu)最初是繼發(fā)于內(nèi)在刺激和外部刺激的代償現(xiàn)象，最終會發(fā)展成為右心衰竭，是肺動脈高壓患者死亡的重要原因。因此，抑制右心室重構(gòu)發(fā)展具有重要意義。心肌細胞凋亡作為細胞死亡的方式之一，與細胞壞死一道，共同調(diào)控心肌細胞數(shù)量，是各種病因?qū)е滦氖抑貥?gòu)的重要環(huán)節(jié)。 匯利心康(GCIP-27)是我室針對心肌肥

3、大發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用的Gaq羧基末端，克隆制備的一種G蛋白競爭性抑制性肽。既往研究證實：GCIP-27能有效抑制Angll，NA誘導的離體心肌細胞肥大反應，抑制不同動物模型的左心室重構(gòu)，并且GCIP-27抑制自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)左心室重構(gòu)幾乎不依賴于其降低體循環(huán)動脈壓作用。另外，GCIP-27還可抑制SHR主動脈平滑肌重構(gòu)效應以及抑制Angll所誘導體外血管平滑肌細胞增殖效應。為此，本課題擬對GCIP-27防治MCT所誘

4、導的肺動脈高壓及右心室重構(gòu)作用及機制進行了探索性研究。 白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種天然多酚類化合物，對心血管有多種益處。Res能抑制Ang-II，PE所誘導的離體心肌細胞肥大反應及抑制心肌成纖維細胞增殖和分化，抑制不同模型的左心室重構(gòu)；另外，還具有保護肺血管內(nèi)皮及抑制Ang-II等引起的體外的大鼠主動脈平滑肌細胞增殖作用；Res苷具有抑制急、慢性低氧型肺動脈高壓作用。鑒于目前尚缺乏針對性防治肺動脈高壓和右心

5、室重構(gòu)藥物，為了拓寬篩選領域，本課題一并研究Res對MCT所誘導的大鼠肺動脈高壓及右心室重構(gòu)的防治影響。 方法： ♂SD大鼠隨機分為正常對照組(control組，n=8)、MCT模型組(MCT組，n=12)、GCIP-27低劑量預防處理組(GCIP-27-P-L組，n=8)、GCIP-27高劑量預防處理組(GCIP-27-P-H，n=8)、GCIP-27治療處理組(GCIP-27-T-H，n=8)、Res低劑量預防處理組

6、(Res-P-L組，n=8)，Res高劑量預防處理組(Res-P-H組，n=8)，Res治療處理組(Res-T-H組，n=8)。大鼠頸背部一次性皮下注射MCT(50 mg/kg)造模，于造模后1-21d或14-21d分別給GCIP-27(30，90μg/kg，ip，bid)或Res(10，30 mg/kg，ig，bid)處理。在實驗過程中，觀察動物一般狀況及動物死亡情況；在實驗第21d，用彩色多普勒超聲成像技術( CDFA)和肺脈沖多普

7、勒技術(PW)觀察所有存活動物的肺動脈加速時間(PAAT)、右心室游離壁厚度(RVFWT)、和三尖瓣返流等指標的變化；在實驗第22d用右心導管術檢測肺動脈收縮壓(PASP)、肺動脈舒張壓(PADP)、平均肺動脈壓(MPAP)、右心室收縮壓( RVSP)等指標；用稱重法測量和計算右心室肥大指數(shù)[RVHI=RV/(LV+SEP)]、右心室質(zhì)量指數(shù)(RVMI=RV/BW)、肺重指數(shù)(LI=LUNG/BW)；用石蠟包埋處理肺或右心室標本；用偏振

8、光顯微鏡觀察右心室及肺HE染色形態(tài)學改變及免疫組化技術處理的相關抗原表達等變化：用透射電鏡技術(TEM)觀察右心室超微結(jié)構(gòu)；用TdT介導的缺口末端標記法(TNNEL)檢測右心室心肌細胞凋亡的變化，用免疫組織化學技術觀察肺動脈α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA抗原)，增殖細胞核抗原(PCNA)，第八因子抗原表達的變化，以及右心室Bcl-2抗原和Bax抗原表達的變化。另外，針對造模后第14d-21d給予GCIP-27或Res處置的動物、正常對照

9、組動物和單純MCT模型組動物，我們用CDFA和PW技術觀察了這些動物在造模前、造模第14d、造模第21d的PAAT、RVFWT等指標的動態(tài)變化。 結(jié)果： 1.MCT模型組有33％動物死亡，盡管這組動物開始時數(shù)目為12只，但在實驗期間分別于13d、14d、19d和20d各死亡1只動物，故該組僅剩8只存活動物進入超聲及血流動力學檢測。其余存活MCT模型組大鼠一般狀況差，體重降低明顯；而GCIP-27或Res處理組無一只動物死

10、亡，一般狀況較好，并且顯著改善MCT所引起的體重下降。 2.與造模前相比，MCT顯著縮短大鼠的第14 d和21 d的PAAT(P<0.01)；與MCT組第21d相比，GCIP-27或Res明顯改善MCT所誘導的PAAT的縮短(P<0.05或P<0.01)；在造模第14-21d，給予GCIP-27或Res處置的MCT造模的大鼠，其第21天PAAT值比第14天的PAAT值延長(P<0.05)。 3.與正常對照組相比，MCT明

11、顯升高PASP、PADP、MPAP、RVSP(P<0.01)；與MCT組相比，GCIP-27顯著抑制MCT所誘導的PASP、RVSP的升高(P<0.05，P<0.01)，但僅GCIP-27-P-H處理組顯著抑制MCT所誘導的MPAP的升高(P<0.05)；與MCT組相比，除了對PADP沒有顯著水平的降低外(P>0.05)，Res明顯改善上述所有指標的變化( P<0.05，P<0.01)。 4.偏振光學顯微鏡觀察左.肺.組織HE染

12、色的病理結(jié)構(gòu)揭示：MCT引起明顯的肺間質(zhì)炎癥，與正常對照相比，顯著增加LI、肺小動脈中膜相對厚度(p/0.01)，上調(diào)肺動脈α-SMA抗原的表達(P<0.01)，增加PCNA抗原核陽性的PASMCs數(shù)目(P<0.01)；與MCT組相比，GCIP-27和Res均一定程度減輕肺間質(zhì)炎癥，并且二者均不同程度顯著地改善上述指標的變化(P<0.05，P<0.01)。 5.MCT明顯減少肺小動脈第八因子抗原的表達，減少肺毛細血管數(shù)量(P<0

13、.01)；與MCT組相比，Res不同程度地增加肺動脈第八因子抗原的表達，增加肺毛細血管數(shù)量( P<0.05，P<0.01)。 6.與造模前相比，MCT顯著升高大鼠第14 d和21d的RVFWT(P<0.01)，在造模21d，MCT組出現(xiàn)75％三尖瓣返流；與MCT組相比，GCIP-27或Res明顯改善MCT所誘導的RVFWT的增加(P<0.05，P<0.01)，并且GCIP-27或Res處理的動物均無三尖瓣返流；在造模第14-21

14、d，給予GCIP-27或Res處置的MCT造模的大鼠，其第21天RVFWT值比第14天的RVFWT值明顯減少(P<0.01)。 7.與正常對照組相比，MCT明顯升高RVHI、RVMI(P<0.01)；與MCT組相比，GCIP-27顯著抑制MCT所誘導的RVHI和RVMI的增高(p<0.01)；與MCT組相比，Res也顯著抑制MCT所誘導的RVHI，RVMI的增高(P<0.05，P<0.01)。 8.偏振光學顯微鏡觀察右心

15、室組織HE染色的病理結(jié)構(gòu)揭示：MCT組心肌細胞排列紊亂，心肌細胞橫截面積和細胞長度均顯著增加，胞漿腫脹，心肌細胞間質(zhì)增生等。與MCT組相比，GCIP-27及Res均不同程度地明顯抑制MCT所引起的右心室組織病理結(jié)構(gòu)改變。 9.TEM觀察右心室心肌細胞超微結(jié)構(gòu)顯示：右心室心肌細胞線粒體腫脹、內(nèi)有空泡形成、呈髓鞘樣退行性改變、肌漿網(wǎng)擴張、橫紋、Z線不清、肌絲排列紊亂及部分肌絲局灶性壞死：與MCT組相比，GCIP-27及Res均不同程

16、度地明顯改善MCT所引起的右心室心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 10. MCT明顯增加右心室心肌細胞TUNEL陽性心肌細胞的數(shù)量(P<0.01)，下調(diào)右心室心肌細胞的Bcl-2抗原的表達(P<0.01)和上調(diào)心肌細胞的Bax抗原的表達(P<0.01)；與MCT組相比，GCIP-27顯著改善MCT所引起上述指標的變化(P<0.01)；Res也改善MCT所引起上述改變(P<0.05，P<0.01)。 結(jié)論： 1.GCIP-

17、27特異性抑制MCT誘導的右心室重構(gòu)效應，與抗心肌細胞凋亡及一定程度地降低肺動脈高壓作用相關。 2.GCIP-27通過上調(diào)心肌細胞Bcl-2抗原、下調(diào)Bax抗原的表達、保護心肌細胞的線粒體及一定程度降低右心室后負荷而抑制右心室心肌細胞凋亡。 3.GCIP-27抑制PASMCs增殖、改善肺動脈重構(gòu)，一定程度地抑制MCT誘導的肺動脈高壓。 4.Res抑制MCT誘導的右心室重構(gòu)，與抗心肌細胞凋亡及降低肺動脈高壓作用相關