TLR7-8配體R-848體內(nèi)外抑制小鼠IgE的產(chǎn)生及作用機(jī)制的探討.pdf

1、變態(tài)反應(yīng)性疾病(allergic disease)是指機(jī)體免疫應(yīng)答的異?；蜻^(guò)強(qiáng)所導(dǎo)致的疾病。在臨床上通常將由Ⅰ型超敏反應(yīng)引起的疾病稱(chēng)之為變態(tài)反應(yīng)性疾病，包括哮喘、過(guò)敏性鼻炎等。在過(guò)去的近半個(gè)世紀(jì)，世界范圍內(nèi)尤其是在西方發(fā)達(dá)國(guó)家，哮喘和過(guò)敏性鼻炎等變態(tài)反應(yīng)性疾病有了顯著的增加。 流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，在過(guò)去幾十年變態(tài)反應(yīng)性疾病發(fā)病率得顯著增加與細(xì)菌或病毒感染性疾病得減少相伴隨。人們注意到“衛(wèi)生”的生活環(huán)境可能增加變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病風(fēng)

2、險(xiǎn)。1989年，Strachan在過(guò)敏性鼻炎的流行病學(xué)研究基礎(chǔ)上，提出了衛(wèi)生假說(shuō)(hygiene hypothesis)，即生活的“衛(wèi)生化”能夠增加變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。兒童(尤其是嬰幼兒)的免疫系統(tǒng)偏向Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，機(jī)體需要在合適的時(shí)間接受適當(dāng)?shù)丨h(huán)境刺激(如自然發(fā)生的感染或接觸微生物)，使免疫系統(tǒng)Th1/Th2的比例達(dá)到平衡。隨著人們生活環(huán)境的“衛(wèi)生化”以及醫(yī)療條件的改善使得感染減少，導(dǎo)致兒童尤其是嬰幼兒時(shí)期接觸微生物

3、的機(jī)會(huì)減少，機(jī)體免疫系統(tǒng)的Th1/Th2比例失衡，在變應(yīng)原、遺傳背景的綜合作用下，變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病率就呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。 衛(wèi)生假說(shuō)的免疫學(xué)基礎(chǔ)是：變態(tài)反應(yīng)性疾病是以Th2免疫應(yīng)答為主。研究證明Th2細(xì)胞因子IL—4或IL-13誘導(dǎo)IgE的產(chǎn)生，而IgE在變態(tài)反應(yīng)性疾病的病理形成過(guò)程中起著非常重要的作用。IgE在正常人體內(nèi)含量很低，在變態(tài)反應(yīng)性疾病患者體內(nèi)IgE的含量明顯升高。IgE的重鏈末端可與肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞等細(xì)胞

4、上的IgE受體FcεRⅠ高親和力結(jié)合，機(jī)體處于致敏狀態(tài)；當(dāng)再次接觸相同變應(yīng)原后，變應(yīng)原與致敏的肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE特異性結(jié)合，導(dǎo)致炎性介質(zhì)地釋放和合成，從而介導(dǎo)Ⅰ型超敏反應(yīng)(即變態(tài)反應(yīng)性疾病)的發(fā)生。IgE的產(chǎn)生受機(jī)體的嚴(yán)密調(diào)控：B細(xì)胞經(jīng)抗原活化后，在Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL—4或IL-13以及其表面分子CD40L的輔助下，經(jīng)過(guò)類(lèi)別轉(zhuǎn)化，分化為漿細(xì)胞產(chǎn)生的。研究發(fā)現(xiàn)IFN—γ和IL-12能夠負(fù)調(diào)控IgE的產(chǎn)生。

5、 目前，針對(duì)變態(tài)反應(yīng)性疾病的治療手段主要是藥物對(duì)癥治療來(lái)改善患者的臨床癥狀。雖然傳統(tǒng)的變應(yīng)原免疫治療能夠改變疾病的進(jìn)程，但因自身的局限性使其在臨床的應(yīng)用受到限制。因此尋求新的有效的治療方法就顯得非常重要。 R—837(Imiquimod)為可溶性小分子免疫調(diào)節(jié)劑，屬咪唑喹啉類(lèi)化合物，通過(guò)TLR7發(fā)揮作用。經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)，用于外生殖器疣、肛周疣，及日光性角化病和基底細(xì)胞癌等病的治療。替代R—837的某些化學(xué)基團(tuán)研制而成其類(lèi)似物

6、R—848，其作用強(qiáng)于R—837。R—848主要通過(guò)TLR7/MyD88途徑和TLR8發(fā)揮作用。TLR7/8的配體R—848不但能夠誘導(dǎo)pDCs和mDCs分別產(chǎn)生IFN—α和IL-12，還能上調(diào)其協(xié)同刺激分子CD40、CD80和CD86的表達(dá)增強(qiáng)DCs的抗原提呈功能，從而誘導(dǎo)初始CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h1細(xì)胞。 本論文研究的主要目的是：利用TLR的配體模擬微生物感染，觀察：1.R—848在體外對(duì)B細(xì)胞的作用，以及對(duì)anti—CD

7、40+IL—4誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE的調(diào)節(jié)及其機(jī)制；2.R—848在體內(nèi)對(duì)OVA+ALUM誘導(dǎo)IgE的產(chǎn)生的調(diào)節(jié)。該研究將為R—848進(jìn)一步用于治療變態(tài)反應(yīng)性疾病提供理論依據(jù)。 本論文研究的內(nèi)容主要有以下三個(gè)部分： 第一部分，探討R—848在體外單獨(dú)對(duì)B細(xì)胞的作用包括對(duì)小鼠B細(xì)胞地活化、分裂和抗體產(chǎn)生的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)R—848能夠直接作用于B細(xì)胞，促進(jìn)B細(xì)胞活化和分裂。更重要的是，R—848以劑量依賴(lài)方式誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生

8、IgG2a和IgG1，且以IgG2a的產(chǎn)生為主。R—848誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IgG2a和IgG1，其機(jī)制可能與其誘導(dǎo)IFN—γ．IL—6、IL-10有關(guān)。R—848對(duì)B細(xì)胞的作用或許是其作為佐劑在體內(nèi)增強(qiáng)免疫應(yīng)答的一個(gè)原因。 第二部分，探討R—848在體外對(duì)anti—CD40+IL—4誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IgE的調(diào)節(jié)及其機(jī)制。結(jié)果表明R—848以劑量依賴(lài)方式在早期抑制anti—CD40+IL—4誘導(dǎo)的脾細(xì)胞產(chǎn)生IgE。檢測(cè)其他I

9、g亞類(lèi)IgG1和IgG2a，發(fā)現(xiàn)R—848同時(shí)也抑制anti—CD40+IL—4誘導(dǎo)的脾細(xì)胞產(chǎn)生IgG1，對(duì)IgG2a的產(chǎn)生無(wú)明顯影響。R—848抑制IgE的產(chǎn)生部分是通過(guò)增強(qiáng)anti—CD40+IL—4誘導(dǎo)的脾細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IFN—γ和IL-12，因?yàn)榭笽FN—γ或抗IL-12的中和抗體部分逆轉(zhuǎn)R—848介導(dǎo)的IgE抑制作用。另外，R—848抑制anti—CD40+IL—4誘導(dǎo)的脾細(xì)胞中B細(xì)胞的增殖和分裂，與其抑制IgE的產(chǎn)生有關(guān)。

10、進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明R—848能夠直接作用于B細(xì)胞抑制anti—CD40+IL—4誘導(dǎo)的純化B細(xì)胞產(chǎn)生IgE。 第三部分，探討R—848在體內(nèi)對(duì)OVA+ALUM誘導(dǎo)的IgE產(chǎn)生的作用，以及對(duì)OVA誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答的影響。結(jié)果顯示R—848能抑制OVA+ALUM誘導(dǎo)的血清中OVA特異性IgE和總IgE的產(chǎn)生，不抑制OVA+ALUM誘導(dǎo)的血清中OVA特異性IgG1的產(chǎn)生，同時(shí)增強(qiáng)血清中OVA特異性IgG2a的產(chǎn)生。進(jìn)一步檢測(cè)脾細(xì)胞OVA

11、特異性Th2細(xì)胞因子IL—4和Th1細(xì)胞因子IFN—γ，結(jié)果顯示R—848能夠抑制OVA+ALUM免疫小鼠的脾細(xì)胞OVA特異性IL—4的產(chǎn)生，而促進(jìn)OVA特異性IFN—γ的產(chǎn)生。FACS檢測(cè)結(jié)果顯示R—848能夠減少多克隆活化的Th2細(xì)胞的頻率。R—848與OVA共同免疫，增強(qiáng)血清中OVA特異性IgG2a的產(chǎn)生，對(duì)OVA特異性IgG1無(wú)明顯影響。由上述結(jié)果可知R—848在體內(nèi)能夠抑制OVA+ALUM誘導(dǎo)的OVA特異性IgE和總IgE的產(chǎn)