病毒載體攜帶自殺基因Dm-dNK(果蠅脫氧核糖核苷酸激酶)對(duì)實(shí)體腫瘤雙重分子靶向治療的研究.pdf

1、目的：
　　 自殺基因輔以前藥治療(genedirectedenzymeprodrugtherapy,GDEPT)在近20年的研究中取得較大成績(jī)。廣泛應(yīng)用的基因治療系統(tǒng)為單純皰疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊環(huán)鳥苷(HSV-TK/GCV)系統(tǒng)。HSV-TK有著很高的催化效率,但HSV-TK/GCV得殺傷機(jī)制還未完全明確,而且HSV-TK/GCV系統(tǒng)用于自殺基因輔以前藥治療的主要缺點(diǎn)在于當(dāng)其殺傷靶細(xì)胞后,有毒性的三磷酸化物GCV-TP會(huì)

2、殺傷臨近細(xì)胞。自殺基因輔以前藥治療綜合了分子治療,酶激活前藥治療,基因前藥治療,是基因治療的巨大進(jìn)步,同時(shí)需要增強(qiáng)對(duì)前藥毒性的進(jìn)一步控制。雖然在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的治療效果被肯定,但自殺基因在臨床上的應(yīng)用有著殺傷效率有限及使用安全性問(wèn)題。
　　 果蠅多底物脫氧核苷酸激酶基因(multisubstratedeoxyribonucleosidekinaseofDrosophilamelanogaster,Dm-dNK)能夠催化自然界所有嘌呤嘧

3、啶脫氧核糖核酸的磷酸化反應(yīng),除了其廣泛的底物特異性,這種激酶還表現(xiàn)出驚人的催化效率.要高出我們所曾了解的核酸激酶效率的10-100倍。在最近的實(shí)驗(yàn)中,研究者試著使Dm-dNK在癌細(xì)胞種系中表達(dá)來(lái)起到一種自殺基因的作用,試驗(yàn)成功證明這種酶在癌細(xì)胞表達(dá)的可能性以及其在癌細(xì)胞中酶活性的保持,不僅如此Dm-dNK還增加了癌細(xì)胞對(duì)某些化療藥物的敏感性。
　　 選擇復(fù)制性腺病毒(Conditionallyreplicatingadenovi

4、ruscs,CRAds),也稱為溶瘤腺病毒,它為惡性腫瘤的治療提供了一個(gè)新的平臺(tái)。選擇復(fù)制性腺病毒不但只感染腫瘤細(xì)胞并殺死它們,而且對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有殺傷效果。對(duì)實(shí)體腫瘤同樣效果明顯。選擇復(fù)制性腺病毒克服了傳統(tǒng)基因治療的缺點(diǎn),包括感染率低,沒(méi)有特異性,殺傷效果差等。在放療,化療等傳統(tǒng)治療無(wú)能為力時(shí),CRAds更好的詮釋了其自身的特點(diǎn)。然而,CRAds的復(fù)制有時(shí)難以控制,從而導(dǎo)致它在正常細(xì)胞中的復(fù)制并發(fā)生了副反應(yīng)。這就急需提高它的安全性及可控

5、性。
　　 我們構(gòu)建了新的病毒載體攜帶Dm-DNK,進(jìn)一步我們?cè)隗w外,體內(nèi)試驗(yàn)中檢測(cè)Dm-DNK的抗腫瘤特性。
　　 方法：
　　 一、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 腫瘤細(xì)胞系購(gòu)買于上海細(xì)胞庫(kù),正常細(xì)胞購(gòu)買于ATCC.細(xì)胞使用L-15培養(yǎng)基或高糖DMEM培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含有10%的血清,雙抗。培養(yǎng)環(huán)境為37℃,5%CO2.
　　 二、Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)
　　 細(xì)胞均勻鋪于6孔板(5×105

6、cells/well),24小時(shí)后,給予病毒及前藥處理。48小時(shí)后,提取蛋白液。
　　 取1m110%分離膠溶液,加5ulTEMED后混勻,加入玻璃板內(nèi)底部聚合封口;將槽內(nèi)多余液體倒去,水洗3次,剩余9m1分離膠溶液加5ulTEMED混勻,注入玻璃板內(nèi),加水覆蓋;聚合完成后倒掉水覆蓋物,以10%的積層膠4ml,加入5ulTEMED混勻,注入分離膠上端:插入加樣梳,將凝膠玻璃板放入電泳槽,聚合5-6分鐘,緩慢拔去加樣梳,水洗加樣孔

7、;將樣品和SDS加樣緩沖液等比混合,100℃加熱3分鐘使蛋白變性,按順序加樣;50V電泳,至染料抵達(dá)分離膠與積層膠交界處;100V電泳,至染料抵達(dá)分離膠底部;將硝酸纖維薄膜漂浮于轉(zhuǎn)移緩沖液,借毛細(xì)作用濕潤(rùn),做好標(biāo)記;將3MM濾紙浸泡于轉(zhuǎn)移緩沖液,取下凝膠置于硝酸纖維薄膜上,再置于6張3MM濾紙中間,400mA,電轉(zhuǎn)移30分鐘至硝酸纖維薄膜上:麗春紅S染液染色2分鐘,觀察轉(zhuǎn)膜情況,去離子水清洗,1xTBST平衡3次,每次5分鐘;封閉液封閉

8、1小時(shí),1xTBST洗膜3次,每次5分鐘;加I抗反應(yīng),室溫1小時(shí),1xTBST洗膜3次,每次5分鐘;加2抗,室溫反應(yīng)1小時(shí),1xTBST洗膜三次,每次5分鐘;加入顯色液,每張膜上均勻鋪800ul,作HRP發(fā)光反應(yīng)反應(yīng)2分鐘。將膜倒置,貼于保鮮膜上,折疊,封好,貼于增感屏。在暗室中壓片,曝光于X-光片(Kodak公司),分別曝光30s-5min。
　　 三、酶活性檢測(cè)
　　 蛋白提取液用放射性[3H]標(biāo)記作為底物的核苷酸藥

9、物,混合液在WhatmanDE-81濾紙上反應(yīng)不同時(shí)間后經(jīng)液閃測(cè)量?jī)x測(cè)定放射活性。
　　 四、CPE實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞殺傷
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞,接種于24孔培養(yǎng)板中,24h細(xì)胞貼壁后,吸去上清,按MOI=0,0.1,1,10,100加入病毒,設(shè)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。37℃,5%C02孵箱培養(yǎng)4h后洗去病毒液,每孔加1ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。48h后于倒置顯微鏡下觀察、拍照。
　　 五、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡<

10、br>　　 (1)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞計(jì)數(shù)鋪板,按合適密度鋪板,分別感染病毒,同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照,37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)4h后洗去病毒液,每組加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。感染后24h加入前藥或PBS感染后48h結(jié)束實(shí)驗(yàn)。
　　 (2)Annexin-V-FITC染色
　　 根據(jù)AnnexinV-FITC/PI試劑使用說(shuō)明調(diào)整細(xì)胞為106個(gè)/ml,離心棄上清,加入10μlAnnexinV-FITC和5μlPI,輕搖勻,室溫避光反應(yīng)

11、15min,1h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè),各組細(xì)胞用流式細(xì)胞計(jì)量?jī)x分別進(jìn)行檢測(cè)。
　　 六、細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)
　　 細(xì)胞按照一定密度鋪于96孔板,培養(yǎng)24小時(shí)后,給予病毒及前藥處理,48小時(shí)后,加入MTT(5mg/ml)20μl/孔,孵育4h后小心吸棄孔內(nèi)上清液,加入DMSO100μ1/孔,振蕩10min,酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值(OD570),取3孔平均值記錄結(jié)果。R450型酶標(biāo)儀測(cè)570nm處光吸收值(OD570nm)。以不感染病毒細(xì)

12、胞的OD570nm為標(biāo)準(zhǔn),其他孔的OD570nm與其相比即為該孔的細(xì)胞存活百分?jǐn)?shù),而細(xì)胞殺傷率(%)=1-細(xì)胞存活百分?jǐn)?shù)。
　　 七、裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)
　　 若干只Balb/c裸小鼠,右側(cè)腋下接種生長(zhǎng)良好的腫瘤細(xì)胞懸液。待長(zhǎng)出150-200mm3的腫瘤后,隨機(jī)分為治療組及對(duì)照組,隔天注射1次,注射10天后,腹腔注射前藥;對(duì)照組,腹腔注射PBS共注射10次。觀察裸鼠生存及腫瘤大小,用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤短徑(a)、長(zhǎng)徑(b),按

13、公式V=ab2/2計(jì)算腫瘤體積,按下式計(jì)算抑瘤率:抑瘤率=[(對(duì)照組腫瘤的平均體積.實(shí)驗(yàn)組腫瘤的平均體積)/對(duì)照組腫瘤的平均體積]×100%
　　 結(jié)果：
　　 腫瘤細(xì)胞感染Dm-dNK后保持其酶活性。
　　 在腫瘤細(xì)胞中自殺基因和Dm-dNK聯(lián)合效應(yīng)殺傷腫瘤細(xì)胞的效果較單自殺基因殺傷腫瘤細(xì)胞效果明顯。
　　 感染Dm-dNK的正常細(xì)胞對(duì)照可以觀察到極低的酶活性,強(qiáng)烈的聯(lián)合殺傷效果只在腫瘤細(xì)胞中可以觀察到