PCSK9基因D374Y突變體對(duì)HepG2細(xì)胞功能的影響及轉(zhuǎn)基因豬的制備.pdf

1、PCSK9是人類高膽固醇血癥的主效基因，介導(dǎo)肝臟細(xì)胞LDLR蛋白的胞內(nèi)溶酶體降解途徑，抑制肝臟對(duì)血液中LDL-c的清除作用，從而使膽固醇水平上升。PCSK9的高表達(dá)或功能獲得性突變與動(dòng)脈粥樣硬化疾病有直接的關(guān)系，而且影響肝臟功能、肝臟損傷修復(fù)、膽固醇運(yùn)輸?shù)刃誀?。為了評(píng)估PCSK9過(guò)表達(dá)對(duì)肝臟細(xì)胞功能的潛在影響，本文利用HepG2細(xì)胞對(duì)增殖、遷移、膽固醇運(yùn)輸?shù)缺硇瓦M(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，PCSK9過(guò)表達(dá)不影響HepG2細(xì)胞的增殖能力，但是顯

2、著抑制細(xì)胞的遷移和膽固醇外排的能力。PCSK9對(duì)肝臟細(xì)胞的遷移能力的抑制與膽固醇的調(diào)節(jié)關(guān)系密切。游離膽固醇在細(xì)胞膜上的無(wú)序分布干擾了小G蛋白活性的發(fā)揮和脂筏相關(guān)受體參與的信號(hào)通路的傳導(dǎo)，并參與Erk信號(hào)通路的調(diào)控。豬的心血管系統(tǒng)和血脂代謝方面與人類非常相近，是研究動(dòng)脈粥樣硬化疾病的有力工具。然而豬的個(gè)體差異較大，自然發(fā)病的動(dòng)物缺乏，且誘導(dǎo)病征發(fā)生緩慢，因此沒(méi)有小鼠等模式動(dòng)物的應(yīng)用廣泛。為了加快疾病發(fā)生進(jìn)程，本研究將PCSK9的獲得性突變

3、體D374Y在豬體內(nèi)過(guò)表達(dá)，以期模擬動(dòng)脈血管的病理學(xué)變化。本文中使用人APO啟動(dòng)子調(diào)控PCSK9的表達(dá)，在人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞中驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因載體的有效性，并得到了轉(zhuǎn)基因豬個(gè)體。RNA、蛋白水平的結(jié)果顯示，人PCSK9基因在豬的肝臟中實(shí)現(xiàn)了高表達(dá)。同時(shí)，組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因豬的肝臟有明顯的病變，且免疫組化染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因豬肝臟LDLR表達(dá)量極顯著的低于野生型豬。本研究成功獲得了人PCSK9過(guò)表達(dá)的體細(xì)胞克隆豬，能夠有效的控