Genistein對LDLR---小鼠動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的影響及Urocortin在大鼠過敏性哮喘肺組織中的表達研究.pdf

1、研究背景 動脈粥樣硬化(artherosclerosis，AS)及其并發(fā)癥是人群致病和死亡的重要原因之一。AS被認為是一個多種細胞因子參與的、以炎癥反應(yīng)和纖維細胞增殖為特征的慢性炎癥過程。其中，核因子-кB(nuclear factor-кB，NF-кB)和血管細胞黏附分子-1(vascular celladhesion molecule-1，VCAM-1)是細胞因子誘導(dǎo)的免疫球蛋白超基因家族成員，其表達水平在AS的斑塊病變組織

2、中明顯高于無病變組織。Genistein是在植物雌激素中發(fā)現(xiàn)的大豆異黃酮的主要活性成分，它在結(jié)構(gòu)上與17-β雌二醇相似。研究表明，genistein可以通過抑制抗氧化型LDL的形成，抑制血管平滑肌細胞的增殖以及血栓的形成等途徑發(fā)揮其抗AS作用。Genistein是否通過NF-кB和VCAM-1途徑起到抗AS作用仍值得深入研究。 目的: 觀察genistein對低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠(LDLR-/-)動脈粥樣硬化發(fā)生

3、發(fā)展的影響，以及探討其抗AS作用與NF-кB及VCAM-1的關(guān)系。 方法:隨機將12只雄性LDLR-/-小鼠平分為兩組：模型組和實驗給藥組。6只C57BL/6J小鼠為正常對照組。所有小鼠均給予高脂肪飲食以促成動脈粥樣斑塊的形成。實驗給藥組小鼠皮下注射一定劑量的genistein，同時模型組小鼠皮下注射溶解genistein的載體。56天后處死各實驗組小鼠，分別檢測各組小鼠血清中總的膽固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白及高密度脂蛋白含量

4、；H&E切片染色分析各組小鼠主動脈發(fā)生動脈粥樣硬化斑塊病變情況；半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)及免疫組化檢測分別各組小鼠主動脈組織中VCAM-1的mRNA及NF-кB＆VCAM-1的蛋白水平的表達情況。 結(jié)果: 1.H&E切片染色分析結(jié)果表明，在連續(xù)給藥56天后，模型組小鼠主動脈發(fā)生動脈粥樣硬化斑塊的面積為(6.65±1.51)×10<'6> μm<'2>，與正常對照組(0.65±0.28)×10<'6> μ

5、m<'2>，相比顯著增加(p<0.01)，而實驗給藥組小鼠主動脈發(fā)生AS斑塊的面積為(3.68±1.18)×10<'6> μm<'2>，與模型組相比顯著下降(p<0.05)，同時浸潤的炎癥細胞數(shù)量亦明顯減少； 2.免疫組織化學(xué)染色證明，LDLR-/-模型小鼠(模型組)病變血管與正常對照小鼠(正常對照組)相比，在內(nèi)皮細胞甚至平滑肌細胞中都有大量VCAM-1和NF-кB陽性染色。而與模型組相比，實驗給藥組小鼠病變血管中VCAM-1(

6、p<0.05)和NF-кB(p<0.05)的表達均明顯減少。同時RT-PCR在mRNA水平證明了VCAM-1類似的改變。 3.模型組小鼠血清中TC、LDL、TG和HDL的濃度分別是664.7±42.1 mg/dl，512.3±30.4 mg/dl，189.1±17.1 mg/dl和62.4±13.3mg/dl，與正常對照組相比，血脂顯著升高(p<0.01)，而實驗給藥組小鼠血清中TC、LDL、TG和HDL的濃度分別為639.6±

7、30.1 mg/dl，506.8±46.2 mg/dl，182.8±25.5 mg/dl和68.2±7.5mg/dl，與模型組相比變化不明顯，無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)。 結(jié)論: Genistein能夠阻滯LDLR-/-小鼠AS發(fā)生發(fā)展，這一作用與NF-кB蛋白，VCAM-1蛋白和VCAM-lmRNA的表達相關(guān)。第二部分Urocortin在大鼠過敏性哮喘肺組織中的表達研究。研究背景:支氣管哮喘是一種氣管慢性炎癥性疾病

8、，其發(fā)病的確切機制至今還不是很清楚，但其發(fā)病的過程中，有肥大細胞，嗜酸性粒細胞和T淋巴細胞等多種炎性細胞參與了其過程。Urocortin(UCN)是CRH家族的新成員。目前研究表明，丘腦及外周組織均可以產(chǎn)生UCN，但它們的功能不盡相同，中樞性UCN發(fā)揮的是免疫抑制作用，而外周的UCN所起的是促炎的作用。另外，肥大細胞可以合成分泌UCN，并且UCN可以誘導(dǎo)肥大細胞脫顆粒產(chǎn)生大量促炎因子。哮喘作為有肥大細胞參與的一種炎癥疾病， UCN是否參

9、與其的發(fā)生發(fā)展過程，目前仍無報道。 目的：觀察過敏性哮喘大鼠肺組織中的UCN的表達。并且研究在哮喘大鼠肺組織中糖皮質(zhì)激素對UCN表達的影響。 方法: 隨機將24只SD大鼠分成正常對照組，哮喘模型組和地塞米松給藥組，每組八只。分別給予哮喘模型組和地塞米松給藥組大鼠皮下注射致敏物質(zhì)卵清蛋白(ovalbumin，OVA)，致敏二周后，用含1％的OVA懸浮微粒激發(fā)。糖皮質(zhì)激素組在激發(fā)前半小時注射地塞米松(2mg/kg)。

10、激發(fā)和給藥的時間為一周，每天一次。最后一次OVA激發(fā)前24小時進行支氣管肺泡灌洗，用瑞特染色技術(shù)分析不同炎癥細胞比例及數(shù)量；蘇木素-伊紅染色(hematoxylin&eosine，H&E)切片染色觀察各實驗組大鼠支氣管肺組織炎癥發(fā)生情況；RT-PCR、Westernblot及免疫組織化學(xué)技術(shù)分別分析各實驗組大鼠肺組織中UCNmRNA及蛋白的表達情況。 結(jié)果: 1.病理組織學(xué)分析顯示，與正常對照組相比，哮喘模型組大鼠的肺組

11、織出現(xiàn)明顯的支氣管狹窄，上皮組織增生，支氣管壁水腫，大量炎性細胞浸潤等炎癥反應(yīng)。而地塞米松給藥組大鼠肺組織的炎癥反應(yīng)明顯減輕； 2.支氣管肺泡灌洗和細胞記數(shù)顯示，哮喘模型組支氣管肺泡灌洗液細胞總數(shù)為(36.2±4.6)×10<'6>/ml，與正常對照組(9.5±1.6)×10<'6>/ml，相比顯著增加(p<0.01)，同時嗜酸性細胞、巨噬細胞和淋巴細胞增加明顯，而中性粒細胞變化不明顯。而地塞米松給藥組支氣管肺泡灌洗液細胞總數(shù)為

12、(5.1±0.9)×10<'6>/ml，與哮喘模型組相比顯著下降(p<0.01)，同時嗜酸性細胞、巨噬細胞和淋巴細胞下降明顯，而中性粒細胞變化不明顯： 3.RT-PCR、免疫組化和Western blot分析均證實了正常大鼠肺組織存在uCN的表達。與正常組相比較，哮喘模型組大鼠肺組織UCN在mRNA水平(p<0.01)及蛋白水平(p<0.01)均有顯著提高；而地塞米松組大鼠肺組織UCN的表達則明顯下降(p<0.01)。