TLR-4和IGF-1在小鼠由缺血再灌注及內毒素誘導的心臟損害中的作用研究.pdf

1、第一部分 Toll樣受體4缺失改善小鼠心臟因缺血再灌注引起的功能不全與損傷 目的：在于應用小鼠心臟缺血再灌注模型觀察Toll樣受體4缺失是否會對功能不全與損傷有保護作用，并進一步探討保護作用機制是否通過調節(jié)腺苷酸活化蛋白激酶和絲裂原激活的蛋白激酶這兩種重要調節(jié)酶并檢測內質網應激相關蛋白。 材料與方法： 野生型C3H/HeN和Toll樣受體4（TLR-4）缺失C3H/HeJ小鼠購自美國JacksonLaborato

2、ry。C3H/HeJ小鼠因TLR-4的基因T1r4Lps-d發(fā)生突變，所以不表達功能性的TLR-4蛋白。小鼠麻醉后，在小動物呼吸機輔助呼吸下開胸后顯微鏡下結扎與開放左冠狀動脈前降支制作缺血再灌注模型。開胸后15分鐘缺血，然后60，120分鐘再灌注。實驗分為八組：（1）野生型C3H/HeN小鼠假手術組（n=7），（2）野生型C3H/HeN小鼠缺血再灌注60分鐘組（n=7），（3）野生型C3H/HeN小鼠缺血再灌注120分鐘組（n=7），（

3、4）野生型C3H/HeN小鼠缺血15分鐘組（n=7），（5）Toll樣受體4（TLR-4）缺失C3H/HeJ小鼠假手術組（n=7），（6）TLR-4缺失C3H/HeJ小鼠缺血再灌注60分鐘組（n=7），（7）TLR-4缺失C3H/HeJ小鼠缺血再灌注120分鐘組（n=7），（8）TLR-4缺失C3H/HeJ小鼠缺血15分鐘組（n=7）。缺血再灌注后雙染色技術測定心梗面積。Evan’sblue染色區(qū)域，TTC染色區(qū)域和TTC未染色區(qū)域的大

4、小用ImageProPlus軟件測定。心肌細胞的凋亡使用caspase-3活性熒光測定法和TUNEL試劑盒。酶聯免疫吸附測定法檢測血清促炎癥因子如腫瘤壞死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）和白介素（interleukin，IL）1β和IL-6水平。絲裂原激活的蛋白激酶（Mitogenactivatedproteinkinase，MAPK）和腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activatedProteinKina

5、se，AMPK）及其下游蛋白乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoAcarboxylase，ACC），真核生物翻譯延伸因子-2（eukaryotictranslationelongationfactor-2，eEF2）和內質網應激標志蛋白生長抑制和DNA損傷誘導基因153（GrowtharrestandDNAdamageinducedgene153，Gadd153），糖調節(jié)蛋白78（glucose-regulatedprotein78，G

6、RP78）和肌醇內質網跨膜激酶（inositol-requiringandER-to-nucleusenzyme，IRE）用免疫印跡方法來檢測。 數據均用均數±標準誤表示。多組之間使用GraphPadPrism4中方差分析（ANOVA）與Newman-Keulsposthoc檢驗。P值小于0．05認為有統(tǒng)計學意義。 1．Toll樣受體-4缺失減小了缺血再灌注后心臟梗死的面積； 2．Toll樣受體-4缺失減少了缺血

7、再灌注后心肌細胞的凋亡； 3．小鼠心臟缺血再灌注后血清中促炎癥因子TNF-α，IL-1β和IL-6在Toll樣受體-4缺失鼠中較野生型有所減少； 4．在缺血再灌注Toll樣受體-4缺失小鼠中腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）的激活增強； 5．在缺血再灌注Toll樣受體-4缺失小鼠中其絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）的變化有不同； 6．與野生型相比Toll樣受體-4缺失減輕了因缺血再灌注引起的內質網應激。

8、 第二部分 心臟特異性過表達胰島素樣生長因子1減輕由內毒素誘導的小鼠心功能不全和應激信號的激活 目的：應用脂多糖誘導的小鼠敗血癥模型研究胰島素樣生長因子1在心肌細胞收縮功能，胞內Ca2+處理功能，應激信號的作用及內質網應激中的作用機制。 材料與方法： 年齡（16-20周）與體重（20-25克）配對的雄性FVB與心臟特異性過表達胰島素樣生長因子1（IGF-1）小鼠用于此實驗。IGF-1轉基因小鼠由紐約大學醫(yī)學院P

9、ieroAnversa博士惠贈。實驗分為四組：FVB小鼠對照組（以下文中簡寫為FVB），FVB小鼠脂多糖處理組（FVB-LPS），IGF-1轉基因小鼠對照組（IGF-1）和IGF-1小鼠脂多糖處理組（IGF-1-LPS）。處理組小鼠腹腔注射在消毒生理鹽水中溶解的EscherichiaColi脂多糖（Sigma，USA）根據已發(fā)表的文獻選擇劑量與時間，劑量為4mg/kg，處理時間為6小時，6小時后處死小鼠，繼續(xù)進行下列相關實驗。根據試劑盒

10、說明應用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）測定血清中IGF-1水平。 在Langendorff系統(tǒng)應用LiberaseBlendzyme4酶（Sigma，USA）消化分離單個心肌細胞。單個心肌細胞的存活率為70％左右，選擇外形邊緣清楚收縮自如的單心肌細胞做為觀察對象。將低于致死劑量的EscherichiaColi脂多糖（1μg/ml）與外源性重組IGF-1（50nM）加入或不加入分離好的FVB單心肌細胞進行體外實驗。 使用

11、SoftEdgeMyoCamsystem（IonOptixCorporation，Miltoa，MA，USA）系統(tǒng)評估單個心肌細胞的收縮和舒張功能。AnIonOptixSoitEdgesoftware軟件適用于捕獲心肌細胞在收縮和舒張時長度的變化。細胞收縮和舒張通過下列指標進行評估：收縮峰值（peakshortening，PS）代表細胞收縮時縮短的幅度；最大收縮和舒張速率積分（±dL/dt）代表細胞收縮和舒張的最大速率；到達收縮峰值的時

12、間（timetoPS，TPs）代表細胞收縮時程；90％舒張時間（timeto90％relengthening，TR90）代表細胞舒張到90％的時程（選擇90％而非100％是為了避免收縮時雜亂信號的干擾）。 用fura-2/AM（0．5μM）將心肌細胞固定15分鐘，然后用雙激發(fā)熒光光電系統(tǒng)（Ionoptix）進行熒光標記。然后將心肌細胞放到奧林巴斯IX-70倒置顯微鏡，在40倍油鏡下觀察圖像。細胞內Ca2+濃度的變化通過在360/

13、380兩個波長下fura-2熒光強度（fura-2fluorescenceintensity，FFI）比來推斷；熒光延遲時間用細胞內Ca2+的清除率來衡量，如適合程序的單指數（single-exponential）曲線或雙指數（bi-exponential）曲線。 細胞內活性氧（ROS）的產生的測定是通過分析細胞內5-甲基-2’，7-二氫熒光素雙乙酸鈉的氧化所造成的熒光素強度的變化來推斷的。用蛋白羰基含量實驗來檢測蛋白的損傷。心

14、肌細胞的凋亡使用caspase-3活性熒光測定法。 應激信號蛋白p38，JNK和ERK及與凋亡有關蛋白Bax，Bcl-2以及內質網應激的蛋白標志物GRP78和Gadd153用免疫印跡法測定。GAPDH做為上樣控制。 數據均用均數±標準誤表示。多組之間使用GraphPadPrism4中方差分析（ANOVA）與Tukeyposthoc檢驗。P值小于0．05認為有統(tǒng)計學意義。 結論： 1．在心臟特異性IGF-1

15、過表達小鼠和FVB小鼠中急性脂多糖處理不會影響其血循環(huán)IGF-1的水平； 2．體外實驗表明IGF-1至少部分對脂多糖誘導的心肌細胞收縮功能與細胞內Ca2+處理功能不全有改善； 3．體內實驗表明IGF-1本身不會對小鼠心臟收縮功能與細胞內Ca2+產生影響，心臟特異性過表達IGF-1可減輕由脂多糖誘導的小鼠心臟收縮功能與細胞內Ca2+處理功能不全； 4．IGF-1減少由脂多糖誘導的活性氧簇的產生及蛋白損傷和心肌細胞凋