酪氨酸激酶Fyn誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞Bcl-X選擇性剪切分子機(jī)制的研究.pdf

1、一、研究背景： 胰腺癌是一種惡性程度很高的惡性腫瘤，發(fā)病率在國(guó)內(nèi)外均呈上升趨勢(shì)，目前居消化道癌癥死因的第2位，5年生存率低于4％。早期的侵襲和轉(zhuǎn)移是胰腺癌的重要特征以及不良預(yù)后的關(guān)鍵因素。目前認(rèn)為，信號(hào)分子的異常激活在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用，其中，以非受體酪氨酸激酶Src超家族及相關(guān)信號(hào)分子的活化尤為矚目。非受體酪氨酸激酶Src超家族是由Src、Fyn、Yes、Lyn等成員組成的，該超家族在細(xì)胞的增殖、分化、有絲分裂、凋亡等過(guò)

2、程中起非常重要的作用。研究顯示幾乎所有的實(shí)體瘤均存在Src的高表達(dá)及過(guò)度激活，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。而作為Src家族成員之一的Fyn，可見(jiàn)于腦腫瘤及頭頸部腫瘤中表達(dá)增高的相關(guān)報(bào)道，提示Fyn亦可以參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。然而，目前尚未見(jiàn)Fyn參與胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移及其分子機(jī)制的相關(guān)研究。 在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，瘤細(xì)胞需要從原位脫落進(jìn)入血液循環(huán)而到達(dá)靶器官，只有具備抗失巢凋亡特性的腫瘤細(xì)胞才能在靶器官中生長(zhǎng)，并最終形成轉(zhuǎn)移灶。因此，

3、對(duì)凋亡的調(diào)控可以直接影響腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。盡管目前的研究普遍認(rèn)為，非受體酪氨酸激酶能夠通過(guò)調(diào)控細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，但具體的機(jī)制仍不清楚。腫瘤細(xì)胞抗失巢凋亡的本質(zhì)是相關(guān)信號(hào)分子異?；罨绊懠?xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。在眾多的凋亡相關(guān)基因中，由于Bcl-X能夠在不同情況下，經(jīng)選擇性剪切形成兩種作用相互拮抗的產(chǎn)物，因而備受關(guān)注。Bcl-X是Bcl-2家族成員，該基因轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過(guò)不同的剪切方式形成Bcl-X(L)和Bcl-X(s

4、)兩種剪切體。其中Bcl-X(L)表現(xiàn)出明顯的抗凋亡作用；而B(niǎo)cl-X(s)缺少了與Bcl-2具有高度同源性的63個(gè)氨基酸，表現(xiàn)出促進(jìn)凋亡的作用。然而，Bcl-X基因發(fā)生選擇性剪切的機(jī)制尚不清楚。 目前研究認(rèn)為酪氨酸激酶Fyn并不能直接參與RNA剪切的調(diào)控。Fyn作為一個(gè)多功能的激酶，可以通過(guò)其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域與下游信號(hào)分子結(jié)合并發(fā)揮作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的調(diào)控。值得注意的是，非受體酪氨酸激酶Src超家族與RNA結(jié)合蛋白hnRNPs(h

5、eterogeneous nuclear ribonucleoprotein，核內(nèi)不均一性核糖核蛋白)、Sam68之間存在著相互作用。hnRNPs、Sam68可以作為非受體酪氨酸激酶的底物，受到激活后，通過(guò)結(jié)合在基因的Pre-mRNA序列上，在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。 綜合近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果，我們?cè)O(shè)想蛋白酪氨酸激酶Fyn通過(guò)激活結(jié)合于Bcl-X基因Pre-mRNA序列上的Sam68、hnRNP A2/B

6、1兩個(gè)RNA結(jié)合蛋白，參與Bcl-X的選擇性剪切，改變Bcl-X兩種功能相互拮抗的剪切體比例，影響細(xì)胞凋亡，調(diào)控胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。 二、目的： 本實(shí)驗(yàn)的目的主要分為兩個(gè)部分，一方面是明確非受體酪氨酸激酶Fyn在胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用；另一方面是探究Fyn是否通過(guò)激活其下游靶信號(hào)分子hnRNPA2/Bl、Sam68，從而參與Bcl-X基因的選擇性剪切的調(diào)控，并闡明其分子機(jī)制。明確以上信號(hào)通路及調(diào)控機(jī)制將有助于深入理解胰腺癌

7、侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，并為尋找干預(yù)胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)提供幫助，最終將有助于改善胰腺癌患者的預(yù)后。 三、材料與方法： 1、通過(guò)免疫組化、Real-Time PCR的方法對(duì)28例胰腺癌Fyn的表達(dá)情況進(jìn)行分析，并明確其與胰腺癌臨床病理參數(shù)之間關(guān)系。用放射性同位素P32標(biāo)記的方法對(duì)三種侵襲轉(zhuǎn)移能力不同的胰腺癌細(xì)胞進(jìn)行Fyn激酶活性測(cè)定，明確Fyn活性與胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移能力之間的關(guān)系。 2、將攜帶激酶活性缺失的KD-Fyn

8、( Kinase Dead-Fyn)的腺病毒轉(zhuǎn)染BxPC3胰腺癌細(xì)胞，用放射性同位素P32標(biāo)記的方法進(jìn)行Fyn激酶活性測(cè)定。MTT、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、TUNEL法分別檢測(cè)抑制Fyn活性前后BxPC3細(xì)胞增殖、侵襲能力以及凋亡水平的改變。RT-PCR檢測(cè)Bcl-X基因兩種剪切體比例的變化。并進(jìn)一步將轉(zhuǎn)染KD-Fyn前后的BxPC3細(xì)胞注射于裸鼠皮下，制作裸鼠成瘤模型，通過(guò)對(duì)胰腺癌肝臟轉(zhuǎn)移情況的觀察，在體明確抑制Fyn活性對(duì)BxP

9、C3細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。 3、將轉(zhuǎn)染KD-Fyn前后的BxPC3細(xì)胞進(jìn)行聚丙酰胺二維凝膠電泳，并通過(guò)質(zhì)譜分析，尋找出蛋白質(zhì)差異點(diǎn)。通過(guò)Western-Blot的方法，對(duì)轉(zhuǎn)染KD-Fyn前后BxPC3細(xì)胞中該蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。采用磷酸化的蛋白抗體PY20，對(duì)轉(zhuǎn)染KD-Fyn前后Sam68的磷酸化水平進(jìn)行檢測(cè)。并通過(guò)免疫共沉淀的方法，檢測(cè)Fyn與篩選出的差異蛋白、Sam68是否存在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合關(guān)系。 4、通過(guò)免疫組化

10、的研究方法對(duì)26例胰腺癌hnRNP A2/B1的表達(dá)情況進(jìn)行分析，并明確其與胰腺癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。通過(guò)RNA-免疫共沉淀技術(shù)，檢測(cè)篩選出的差異蛋白hnRNP A2/B1是否與Bcl-X基因的Pre-mRNA結(jié)合并證實(shí)磷酸化水平變化對(duì)Sam68的Bcl-X結(jié)合能力的影響。構(gòu)建重組hnRNP A2/Bl及hnRNP A2/B1 RNAi腺病毒載體，并通過(guò)改變hnRNP A2/B1的表達(dá)水平，觀察對(duì)Bcl-X兩種剪切體比例的影響。

11、 五、結(jié)果及結(jié)論： 1、28例胰腺癌組織標(biāo)本中有24例出現(xiàn)Fyn的表達(dá)，表達(dá)水平與胰腺癌TNM分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與腫瘤大小、分化程度沒(méi)有明顯的關(guān)系。在BxPC3、Paca2、Aspcl三種侵襲轉(zhuǎn)移能力不同的胰腺癌細(xì)胞中，F(xiàn)yn的活性與侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。以上結(jié)果證實(shí)：Fyn胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 2、轉(zhuǎn)染KD-Fyn以后，F(xiàn)yn激酶活性明顯下降。MTT證實(shí)，抑制Fyn活性，明顯抑制了胰腺癌細(xì)胞增殖；T

12、ranswell實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制Fyn活性，明顯降低了胰腺癌細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng)能力。TUNEL染色顯示，抑制Fyn活性，BxPC3胰腺癌細(xì)胞凋亡發(fā)生率明顯增加。在裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)中，抑制Fyn活性可以明顯抑制BxPC3胰腺癌細(xì)胞在裸鼠中的成瘤能力。RT-PCR證實(shí)，抑制Fyn活性明顯改變了凋亡相關(guān)基因Bcl-X的選擇性剪切方式，其中促進(jìn)凋亡的Bcl-X(s)明顯增加，抑制凋亡的Bcl-X(L)明顯降低。以上結(jié)果揭示了當(dāng)抑制Fyn的激酶活性，可以下調(diào)

13、胰腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而這種作用是通過(guò)影響B(tài)cl-X基因選擇性剪切方式改變，進(jìn)而影響胰腺癌細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。 3、聚丙酰胺二維凝膠電泳篩選出了轉(zhuǎn)染KD-Fyn前后的BxPC3細(xì)胞中表達(dá)量發(fā)生改變的多個(gè)差異點(diǎn)蛋白，免疫共沉淀技術(shù)證實(shí)其中的差異點(diǎn)蛋白hnRNP A2/B1及另一個(gè)RNA結(jié)合蛋白Sam68能夠分別與Fyn結(jié)合。Western-Blot證實(shí)，抑制Fyn的活性，hnRNP A2/B1表達(dá)水平下降；Sam68的磷酸化水平下

14、降。以上結(jié)果證實(shí)：Fyn可以結(jié)合并調(diào)控其下游靶信號(hào)分子hnRNP A2/B1的蛋白表達(dá)水平及Sam68的磷酸化水平。 4、將hnRNP A2/B1基因及hnRNP A2/B1 RNAi質(zhì)粒成功克隆入Ad-Easy腺病毒載體中，獲得包含hnRNP A2/B1及hnRNP A2/B1 RNAi的重組腺病毒。該腺病毒可以高效干預(yù)hnRNP A2/B1在BxPC3胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)。 5、28例胰腺癌組織標(biāo)本中有23例出現(xiàn)hnR

15、NP A2/B1的表達(dá)，表達(dá)水平與胰腺癌TNM分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)等因素有關(guān)，而與腫瘤部位、分化程度等沒(méi)有明顯的關(guān)系。RNA-免疫共沉淀證實(shí)，hnRNP A2/B1、Sam68能夠與BxPC3細(xì)胞中Bcl-X基因的Pre-mRNA結(jié)合。磷酸化水平的改變可以影響Sam68與Bcl-X基因的結(jié)合能力；而hnRNP A2/B1表達(dá)水平的改變可以影響B(tài)xPC3胰腺癌細(xì)胞中Bcl-X兩種剪切體的比例 綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)了Fy