靶向ING1基因的miR-622真核表達(dá)載體在胃癌細(xì)胞MKN-45中的鑒定及其功能研究.pdf

1、背景:胃癌是消化道中常見(jiàn)的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率均高,在全部惡性腫瘤其死亡率位于第二位,嚴(yán)重威脅著人民的生活質(zhì)量和生命健康。胃癌的發(fā)生及其發(fā)展是復(fù)雜的,包括多種免疫與分子機(jī)制。胃癌發(fā)生的分子機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)癌基因和抑癌基因在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,但其表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。微小RNA(microRNA,miRNA)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)非編碼小分子RNA,研究發(fā)現(xiàn)它們不僅在生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老、死亡等各個(gè)生物過(guò)程的起到一定的調(diào)

2、控作用,在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用。
　　目的:miRNA的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展有了新的認(rèn)識(shí),已有研究報(bào)道,胃癌中也存在廣泛的microRNA表達(dá)失調(diào)。miR-622是胃癌microRNA中一種,miR-622的研究發(fā)現(xiàn)miR-622直接靶向細(xì)胞周期相關(guān)基因INGl。本研究旨在構(gòu)建miR-622真核表達(dá)載體,建立高表達(dá)miR-622的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株,驗(yàn)證miR-622轉(zhuǎn)染人胃癌MKN-45細(xì)胞后對(duì)靶向細(xì)胞周期I

3、NGl基因的干擾效果并驗(yàn)證miR-622相關(guān)功能。
　　方法:1.以人胃癌細(xì)胞株MKN-45基因組為模板,通過(guò)PCR技術(shù)獲取miR-622前體目的片段。pSuper.gfp/neo載體中插入miR-622前體目的片段構(gòu)建miR-622真核表達(dá)載體。
　　2.將真核表達(dá)載體pSuper/miR-622經(jīng)過(guò)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)轉(zhuǎn)染到人胃癌MKN-45細(xì)胞中,并經(jīng)過(guò)含有G418的培養(yǎng)液篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,高表達(dá)miR-622的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

4、MKN-45細(xì)胞株被建立。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染MKN-45細(xì)胞株:MKN-45-pSupor/miR-622組,對(duì)照組為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細(xì)胞:MKN-45-pSuper組及未處理細(xì)胞MKN-45組。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組miR-622的表達(dá)情況。
　　3.通過(guò)Western blot檢測(cè)INGl蛋白水平表達(dá),檢測(cè)其對(duì)INGl基因表達(dá)的干擾效果;通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增長(zhǎng)情況;細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-622高表

5、達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響。
　　結(jié)果:
　　1.pSuper空載體組INGl蛋白表達(dá)量為10.62±1.04,轉(zhuǎn)染了pSuper/miR-622高表達(dá)質(zhì)粒的MKN-45細(xì)胞中INGl蛋白表達(dá)量為2.32±0.3l;轉(zhuǎn)染了pSuper/miR-622實(shí)驗(yàn)組中INGl蛋白表達(dá)明顯減少,與pSuper空載體組相比降低了4.58倍;
　　2.CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染了pSuper/miR-622實(shí)驗(yàn)組的MKN-45細(xì)

6、胞與pSuper空載體相比,促進(jìn)了胃癌細(xì)胞增殖。
　　3.細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證結(jié)果pSuper/miR-622組在胃癌細(xì)胞G0/G1期為21.45±0.16,pSuper空載體組在G0/G1期為48.21±0.34:pSuper/miR-622組在胃癌細(xì)胞G2/M期為53.674±0.41,pSuper空載體組在G2/M期20.27±0.18;高表達(dá)miR.622的pSuper/miR-622組與pSuper空載體組相比,其促進(jìn)了胃