4-氯苯甲酰小檗胺體內(nèi)外抑制伊馬替尼耐藥K562細胞增殖及機制探討.pdf

1、目的：
　　 研究4-氯苯甲酰小檗胺(BBD9)體內(nèi)外抑制伊馬替尼(IM)耐藥K562細胞(K562R)增殖作用并探討其機制。
　　 方法：
　　 MTT法檢測不同濃度IM，BBD9和小檗胺(BBM)分別處理K562R和K562細胞72h后細胞存活率，并計算出各自IC50值。1μg/mlBBD9和8μg/mlBBM分別處理體外培養(yǎng)K562R細胞48h后，WesternBlot檢測總p210BCR-ABL蛋白表達水

2、平；1μg/mlBBD9處理體外培養(yǎng)K562R細胞不同時間后半定量RT-PCR檢測BCR-ABL融合基因mRNA轉(zhuǎn)錄變化。1μg/mlBBD9和8μg/mlBBM分別處理體外培養(yǎng)K562R細胞48h后WesternBlot檢測IKKα，胞漿和胞核NF-κBp65表達水平。不同濃度BBD9處理體外培養(yǎng)K562R細胞48h后流式細胞術(shù)測定細胞存活、凋亡和壞死比例；WesternBlot檢測PARP，Caspase-3，Caspase-9和L

3、C3-Ⅱ表達水平。裸鼠移植瘤模型觀察BBD9和IM給藥后裸鼠體重、移植瘤瘤重和瘤消退率等指標。
　　 結(jié)果：
　　 (1)K562R細胞對伊馬替尼耐藥的檢測：IM對K562R細胞和K562細胞72hIC50值分別為0.933±0.015μg/ml和0.036μ0.011μg/ml，耐藥細胞約為非耐藥細胞的25.627倍。
　　 (2)BBM對K562R細胞和K562細胞體外殺傷效果：BBM對K562R細胞和K56

4、2細胞72hIC50值分別為7.81±0.711μg/ml和5.14+0.281μg/ml。
　　 (3)BBD9對K562R細胞和K562細胞體外殺傷效果：BBD9對K562R細胞和K562細胞72hIC50值分別為1.02±0.161μg/ml和1.16±0.131μg/ml。
　　 (4)BBD9和BBM對K562R細胞BCR-ABL融合蛋白p210BCR-ABL表達和融合基因mRNA轉(zhuǎn)錄影響：1μg/mlBBD9

5、和8μg/mlBBM分別處理K562R細胞48h后p210BCR-ABL總蛋白均下降且以BBD9作用更明顯，1μg/mlBBD9處理K562R細胞24h后BCR-ABL融合基因mRNA開始下降。
　　 (5)BBD9和BBM對IKKα和NF-κBp65表達的影響：1μg/mlBBD9和8μg/mlBBM分別處理K562R細胞48h后IKKα和胞核NF-κBp65表達均下降且以BBD9作用更明顯，而胞漿NF-κBp65表達兩者均無

6、顯著變化。
　　 (6)BBD9對K562R細胞凋亡、壞死和自噬等死亡通路影響：0、0.5、1、2μg/mlBBD9處理K562R細胞48h后流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示細胞凋亡和壞死均與BBD9呈劑量依賴性關(guān)系；活化的PARp，Caspase-3，Caspase-9和LC3-Ⅱ也隨著BBD9濃度增加而升高。
　　 (7)裸鼠移植瘤模型檢測BBD9體內(nèi)抑瘤效果：裸鼠移植瘤實驗35天結(jié)束后發(fā)現(xiàn)在裸鼠移植瘤瘤重，瘤消退率，和體重等

7、指標上BBD9均優(yōu)于IM，數(shù)據(jù)均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，且裸鼠肝、腎等重要臟器未見肉眼損害。
　　 結(jié)論：
　　 (1)K562R細胞對IM有較高耐藥性，72hIC50值約為非耐藥K562細胞的25.627倍，而對BBM和BBD9則未見耐藥。
　　 (2)BBD9體內(nèi)外均能抑制K562R細胞增殖。機制可能涉及抑制BCR-ABL融合基因轉(zhuǎn)錄而抑制p210BCR-ABL融合蛋白表達，抑制IKKα表達從而抑制胞漿